刘海霞蒋业坤蒋汉茂曾之耀甘小艳徐军发

关于B 7-H 5/CD 28 H信号途径在结直肠癌中的表达以及对抗肿瘤免疫的影响分析

刘海霞1蒋业坤1蒋汉茂1曾之耀1甘小艳1徐军发2

【摘要】目的 通过检测B 7-H 5在不同分期的结直肠癌组织中的表达差异，研究B 7-H 5与肿瘤分期的关系，并通过比较肿瘤浸润细胞对不同表达程度的肿瘤细胞的杀伤试验，探索B 7-H 5在抗肿瘤免疫中的作用。方法 纳入健康志愿者、T1～T4期结直肠癌患者各20例，比较其外周血及组织中B 7-H 5的表达情况；提取组织中的肿瘤浸润细胞，在体外进行扩增，检测其对不同B 7-H 5表达水平肿瘤细胞的杀伤活性。结果 健康人外周血中无B 7-H 5，肿瘤分级越高，血液及组织中B 7-H 5的表达越高，提示B 7-H 5可以作为肿瘤严重程度的潜在指标。肿瘤浸润细胞杀伤试验表明，B 7-H 5是肿瘤杀伤的抑制因素。结论 血液及组织中B 7–H 5的表达含量可作为肿瘤分期及肿瘤免疫治疗疗效预测的潜在指标，但因本试验样本量较小，仍需要进一步的验证。

【关键字】结直肠癌；B 7-H 5；肿瘤浸润细胞

B 7-H 5，又名VISTA、Gi 24或Dies1，是最新鉴定的B 7共刺激分子家族的成员[1]。研究表明[2]，B 7-H 5在成熟的髓系抗原提呈细胞中高表达，而在活化的调节性T细胞中低表达。B 7-H 5主要通过CD-28 H受体信号途径进行信号转导，在适应性免疫中发挥着重要的作用。本项目组前期研究结果显示B 7-H 5 mRNA在结直肠癌组织中的表达低于正常人结直肠组织。本项目拟检测B 7-H 5在不同健康志愿者中，分析结直肠癌组织中的表达，其表达量与分期的关系。同时对组织中的肿瘤浸润细胞进行体外分离扩增，细胞肿瘤杀伤试验，探索B 7-H 5信号通路对抗肿瘤免疫的影响。

1　资料与方法

1.1 B 7-H 5在结健康人及结直肠癌组织中的表达

1.1.1 实验分组 本次实验分为健康志愿者组及结直肠癌患者组。健康志愿者入选标准：（1）年龄40～65岁，男女各半。（2）未患有肿瘤，血、尿、便常规检查正常。（3）志愿签署知情同意书。结直肠癌患者入选标准：（1）年龄40～65岁，男女各半。（2）经病理检查确诊为结肠癌或直肠癌。（3）肿瘤TNM病理分期为T1～T4期，每期各20例，男女各半。最终共入组健康志愿者20例，平均年龄（55.2±12.1）岁，男性10例，女性10例；结直肠癌患者组根据TNM分期进行分组，T1、T2、T3、T4期患者各纳入20例，T1组平均年龄（54.1±12.4）岁，T2组平均年龄（57.1±12.9）岁，T3组平均年龄（51.6±13.4）岁，T4组年龄（59.3±14.1）岁，每组男性10例，女性10例。

1.1.2 样本收集 （1）血液样本：健康志愿者于早晨空腹抽取静脉血10 ml，肝素抗凝；结直肠癌患者于手术前和手术后一周空腹抽静脉血10 ml，肝素抗凝，分离血浆放-80℃冰箱中保存，血细胞分离单个核细胞份两份，一份置1 ml Trizol试剂中并于-80℃冰箱中保存，另一份细胞保存液中置液氮中保存。（2）组织样本：手术中收集肿瘤患者正常肠组织、肠癌组织和癌旁组织，将组织块分成4份，其中一份放液氮中保存、一块置福尔马林中保存、一份放1 ml Trizol试剂中并于-80℃冰箱中保存，第4份提取单个核细胞。

1.1.3 指标检测 （1）采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测健康志愿者及患者的外周血标本中B 7-H 5的含量。（2）采用免疫组化法对组织样本进行检测，检测结直肠正常组织、结直肠癌组织中B 7-H 5的表达情况，组化结果分为4级，1级为阴性，2级为1%～30%的细胞染色，3级为31%～60%的细胞染色，4级为超过60%的细胞染色。

1.2 B 7-H 5/CD 28 H信号途径对抗肿瘤免疫的影响

1.2.1 肿瘤细胞及肿瘤浸润细胞的制备 （1）B 7-H 5（+）肿瘤细胞：直接分离B 7-H 5（+）的肿瘤细胞。（2）B 7-H 5（-）肿瘤细胞：采用B 7-H 5 shRNA慢病毒载体感染肿瘤细胞，沉默肿瘤细胞B 7-H 5的表达。（3）B 7-H 5（++）过表达肿瘤细胞：采用B 7-H 5慢病毒表达载体感染肿瘤细胞，作为B 7-H 5过表达组。（4）肿瘤浸润细胞TILs：从癌组织中直接分离TILs，在体外用高剂量IL-2体外培养达到扩增的目的。

1.2.2 体外抗肿瘤效应试验 采用LDH释放法检测TILs对上述制备的肿瘤细胞进行杀伤试验，检测TILs的抗肿瘤效应，进行杀伤试验的分组。见表1。

表1　 LDH释放法肿瘤杀伤试验分组

表2 术前血液中B 7-H 5含量与肿瘤分期的关系

表3　 术后血液中B 7-H 5含量与肿瘤分期的关系

1.3 统计学方法

采用SPSS 18.0软件进行统计分析，对于连续型变量指标，如果满足正态分布且组间方差齐性检验合格则采用方差分析进行比较，如不满足则采用Wilcoxon秩和检验进行比较；对于率的指标采用χ2检验进行比较，P＜0.05，差异具有统计学意义。

2　结果

试验结果表明，手术前及手术后，健康志愿者血液中的可溶性B 7-H 5含量与及各级肿瘤患者均无统计学差异。见表3、表4。

3　讨论

近年来，肿瘤的发病率逐渐增高，尤其是恶性肿瘤，已成为危害人类健康的主要疾病之一[3]。细胞免疫在抗肿瘤免疫中起决定性作用，研究发现[4]肿瘤患者细胞免疫功能低下，可能是肿瘤免疫逃逸的重要原因。探讨肿瘤逃逸、机体抗肿瘤细胞免疫作用的机制不仅对阐明肿瘤免疫的基本原理具有重要意义，也将为肿瘤免疫治疗提供理论依据。机体肿瘤免疫主要是由T细胞介导的细胞免疫，其通过对肿瘤特异性抗原进行识别，活化T细胞，产生肿瘤特异性效应T细胞[5]，进而发挥其特异性的免疫杀伤作用。初始T细胞活化的双信号学说已获公认，该学说认为初始T细胞活化需要两个信号共同参与，即T细胞受体（TCR）与抗原肽-MHC复合物特异性结合的第一信号，APCs表面的B 7家族或其它共信号分子与其受体结合的第二信号。当第二信号缺乏时，T细胞识别抗原后将不能有效增殖，导致免疫无应答，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。

综上所述，B 7-H 5分子的表达与结直肠癌肿瘤恶性程度具有一定的相关性，这使得B 7-H 5有可能作为结直肠癌恶性程度及预后的预测指标之一。

参考文献

[1] Ceeraz S, Nowak EC, Noelle RJ. B7 family checkpoint regulators in immune regulation and disease[J]. Trends in immunology，2013，34 （11）：5565-5563.

[2] 张蕾，李芳秋，张士新，等. LDH释放法检测肿瘤患者PBMC 和CIK细胞的细胞毒活性[J]. 现代检验医学杂志，2008，23（6）：27-29.

[3] Dong H, Chen L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity [J]. J Mol Med （Berl），2003，81（5）：281-287.

[4] Kryczek I, Wei S, Zhu G, et al. Relationship between B7-H4, regulatory T cells, and patient outcome in human ovarian carcinoma[J]. Cancer research，2007，67（18）：8900-8905.

[5] Zhu Y, Yao S, Iliopoulou BP, et al. B7-H5 costimulates human T cells via CD28H[J]. Nat Commun，2013（4）：2043.

作者单位：1 425000湖南省永州市中心医院；2 523808东莞，广东医学院

Analysis Effect of B 7-H 5/CD 28 H Signal Pathway Expression in Colorectal Cancer and Antitumor Immune

LIU Haixia1JIANG Yekun1JIANG Hanmao1ZENG Zhiyao1GAN Xiaoyan1XU Junfa21 Yongzhou Central Hospital in Hu’nan Province, Yongzhou 425000, China. 2 Guangdong Medical College, Dongguan 523808, China

[Abstract]Objective Through the detection of B 7-H 5 expression differences in different stages of colorectal cancer tissue, study the B 7-H 5 and the relationship between the tumor stage, and by compare the tumor infiltrating cells destruction test on different expression level of tumor cells, explore the B 7–H 5 role in antitumor immunity. Methods In healthy volunteers, T 1-T 4 and 20 patients with colorectal cancer, compare the B 7–H 5 expression in peripheral blood and tissue, Extract the tumor infiltration in the tissue cells, in vitro amplification, detection of the expression level of different B 7–H 5 tumor cell killing activity. Results Healthy people without B 7–H 5 in peripheral blood, the higher the tumor grade, blood and tissue in the higher expression of B 7–H 5, prompt B 7–H 5 can be used as potential index of the extent of tumor. Tumor infiltrating cells selectively. the test showed that B 7–H 5 was tumor inhibitory factors. Conclusion The expression of B 7–H 5 content in blood and tissue can be use as a tumor stage and tumor immunotherapy effect forecast potential index, but because of the test sample size is lesser, still needs further validation.

[Key words]Colorectal cancer, B 7–H 5, Tumor infiltrating cells

基金项目：湖南省卫生厅科研基金课题申请书（课题号：B2014-179）课题名称（B7-H5/CD28H信号途径在结直肠癌中的表达及其对抗肿瘤免疫的影响）

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.23.032

【文章编号】1674-9308（2015）23-0046-02

【文献标识码】B

【中图分类号】R735.3+7