王 睿综述， 金 风审校

(1.贵州医科大学， 贵阳 550004;.贵州医科大学附属医院肿瘤科 贵州省肿瘤医院头颈肿瘤科， 贵阳 550004)

•综述与讲座•

Per家族基因在相关恶性肿瘤中的研究及进展*

王 睿1综述， 金 风2△审校

(1.贵州医科大学， 贵阳 550004;.贵州医科大学附属医院肿瘤科 贵州省肿瘤医院头颈肿瘤科， 贵阳 550004)

近年来，时钟基因(circadian clocks)与肿瘤发生及预后关系的研究已成为热点，迄今的研究也证明时钟基因的核心基因Per家族基因与肿瘤表达及预后之间有密切联系。同时，根据生物节律变化而采用的时辰治疗模式也在积极探索中且在临床研究中取得了一定的结果。本文针对Per家族基因在相关恶性肿瘤中的研究及Per家族基因同时辰治疗的联系进行综述。

Per家族基因； 肿瘤； 时辰治疗

时钟基因(circadian clocks)首次发现于甲虫眼外光感受器形成及功能的研究中。目前研究发现的时钟基因至少包括9种，即：Period-1(Per1)，Period-2(Per2)，Period-3(Per3)，circadian locomotor output cycle kaput(CLOCK)， Cryptochrome-1(CRY1)，Cryptochrome-2(CRY2)，the brain and muscle Arnt-like protein-1(BMAL1)，Casein kinase-1(CK1)和Timelss(TIM)。人类、动物及许多植物都拥有一个内在的调节生理行为和生化周期节奏的生物钟，并使之与一天24小时的昼夜循环相一致。正常昼夜节律的改变促使了细胞的异常增殖，从而导致时钟基因规律调节人体的各种生理过程发生改变，包括血压、激素分泌、睡眠和免疫活动等。昼夜节律的紊乱可能会增加疾病发生的风险，如心血管疾病、免疫系统疾病和癌症等。Per家族基因作为一个大团体，其成员Per1、Per2、Per3在时钟基因调节体内生物钟变化中起到了至关重要的作用。

目前兴起的时辰治疗模式是基于生物体内昼夜节律变化而采用的一种个体化治疗模式，但是在关于时辰治疗理论基础研究中，鲜少与时钟基因相关联。

因此对时钟基因Per家族基因及其同肿瘤相关性的研究，有望为未来时辰治疗提供坚实的理论基础及对时辰治疗模式改进提供一种新的探索途径。

1 Per家族基因

Per家族基因广泛存在于原核生物和真核生物中。Yagita等[1]研究表明，在哺乳动物中Per基因的中枢调节点位于下丘脑视交叉上。Per家族基因的启动子上游均带有E-box序列，因此CLOCK等基因可分别与Per家族基因的调控蛋白相结合，激活基因转录生成Per家族基因mRNA，在核内产生的mRNA, 通过一定的正反馈路径进入细胞质合成相应的蛋白质[2]，即Per1、Per2、Per3蛋白。在遗传学研究中提示，体内生物钟重要的调节因子CKIε,其主要的反应底物则是Per2蛋白。Per2的激酶结合区域的调节因子CKIε若发生磷酸化突变，将会导致CKIε的活性降低，从而使人体内部昼夜节律的长度缩短。同时Per2蛋白自身的磷酸化也可以被蛋白激酶及蛋白磷酸酶调控，蛋白激酶及蛋白磷酸酶活性的降低将导致Per2蛋白的磷酸化、泛素化及降解[3-4]。一项关于小鼠的研究也表明，Per家族基因主要通过两个机制抑制肿瘤的形成：一方面促进细胞对射线引起的DNA损伤进行自身修复；另一方面通过对抑癌基因p53的调控发挥作用[5]。

2 Per家族基因与肿瘤之间的关系

2.1 Per2基因与非小细胞肺癌的关系

目前全球范围内，肺癌的发病率及病死率均居恶性肿瘤之首，5年生存率仅为16.8%[6]。我国2010年的一项调查研究结果也提示肺癌的发病率和病死率居所有恶性肿瘤的第一位[7]。目前时钟基因的核心基因Per家族基因在肺癌中的研究相对较少。池闯等[8]采用免疫组化法检测60例非小细胞肺癌与同期肺大疱和肺囊肿接受手术治疗的20例患者的正常肺组织中Per2蛋白表达情况，比较发现：Per2蛋白在非小细胞肺癌组织中阳性表达率为71.7%，而在正常肺组织中阳性表达率高达95%，差异有统计学意义(P=0.030)。同时Ⅰ期肺癌患者Per2蛋白的阳性表达率为86%，而Ⅲ期肺癌患者阳性表达率仅为50%，差异有统计学意义(P=0.046)。上述实验结果显示：Per2蛋白在非小细胞肺癌中的表达明显降低；同时肿瘤TNM分期越晚，Per2蛋白阳性表达率也越低。

2.2 Per家族基因与腹部肿瘤的关系

腹部肿瘤作为人类常见肿瘤之一，目前相关手术、放化疗治疗的研究取得了不小的进展，但腹部肿瘤尤其是肝癌、胰腺癌等的死亡率仍较高。因此寻找影响腹部肿瘤发生发展起重要作用的基因，研究其功能，对评价预后、早期诊断及研制基因药物具有重要作用。Mazzoccoli等[9]选取了19例09：00～17:00接受直肠癌根治术的患者，采用实时定量PCR法检测肿瘤组织中Per基因的表达情况，发现生存率低的患者Per基因表达下调水平高于生存率高的患者，差异有统计学意义(P=0.026)。王雅平等[10]共收集38例未经放化疗的结肠癌病例，每例分别取肿瘤组织及肿瘤边缘5 cm以上的正常组织，通过免疫组化法检测发现，38例患者中Per2蛋白在癌组织及癌旁组织中的阳性表达率分别为81.6%及97.7%(P<0.05)。T1a～T2期的9例病例中，Per2蛋白表达下调33.3%，而T3～T4期的29例病例中，Per2蛋白表达下调72.4%(P<0.01)。其结果显示Per2蛋白在结肠癌组织及正常结肠组织中均有表达，但癌组织较正常组织表达明显下调，且TNM分期越晚，表达程度越低。Yang等[11]在一项关于肝细胞肝癌的实验中也提示，Per家族基因在肝细胞肝癌组织中的表达为低表达。另外，该研究还发现，在缺氧情况下，肝癌细胞中Per家族基因的表达与不缺氧环境下培养的肝癌细胞相比明显下降，这说明环境因素特别是氧含量的变化将会影响Per家族基因的表达[12]。金涛等[13]在一项关于乙肝病毒X蛋白(Hbx)在正常肝细胞组织表达的研究中表明，转染了Hbx后，肝细胞中Per家族基因表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.05)。而乙肝作为肝癌的常见诱因，也间接预示Per基因的表达与肝癌的发生密切相关。在胰腺癌的研究中，Relles等[14]选取了2005年至2012年上午10点至下午2点行胰腺癌肿瘤切除术的65例病例，采用实时定量PCR法检测的结果表明：Per1、Per2、Per3基因表达水平降低，随后他们根据基因表达水平将65例病例分为两组，一组为相对高表达组，一组为相对低表达组，统计2年生存率发现，Per1相对高表达组和相对低表达组两年生存率分别为42.9%、21%(P=0.026)，Per2相对高表达组和相对低表达组两年生存率分别为47.6%、18.7%(P=0.040)，Per3相对高表达组和相对低表达组两年生存率分别为43.3%、24.3%(P=0.040)。上述结果提示，Per基因的低表达与胰腺癌患者低生存率之间具有密切联系。

2.3 Per家族基因与乳腺癌之间关系

目前，乳腺癌已成为女性发病率最高的恶性肿瘤之一。2008年，GLOBOCAN针对全球约1 270万癌症病人及760例癌症死亡病例患者的分析，首次证实乳腺癌的发病率及死亡率已跃居女性恶性肿瘤首位。在我国目前乳腺癌的发病率约为55/10万。流行病学研究表明，长期上夜班的女性人群乳腺癌的发病率明显高于正常上班的人群，可见昼夜节律的紊乱与乳腺癌的发生具有密切联系。在一项关于散发性及家族性乳腺癌的研究中，Winter等[15]共选取34例散发乳腺癌病例及11例家族性乳腺癌病例，通过PCR法检测发现，散发性乳腺癌病例中Per1、Per2的平均表达量为1.8(P<0.001)、3.6(P<0.05)，而家族性乳腺癌病例中Per1、Per2的平均表达量仅为0.9、2.6，差异有统计学意义(P<0.001)。更重要的是，无论是家族性乳腺癌还是散发性乳腺癌，其Per1、Per2的表达水平较正常乳腺组织均下降。进一步研究中他们又将乳腺癌病例分为Per1相对低表达组和Per1相对高表达组进行比较发现，Per1相对低表达的病例中有50%的患者中雌激素受体处于非激活状态而Per1相对高表达的病例中仅有15.4%的患者雌激素受体处于非激活状态。但并未发现Per2基因与雌激素受体具有相关联系，这也暗示Per1低表达可能与激素受体功能异常有关。在多项关于Per基因同乳腺癌关系的研究中，都证实乳腺癌患者Per基因的启动子大量甲基化。而关于Per3基因的多态性与乳腺癌发生的相关性，也在国外得到了大量报道及证实。Zhu[16]等收集了389例白种人乳腺癌患者及432例正常白种人妇女血液标本，利用PCR法检测发现，乳腺癌患者中Per3基因型为阳性纯合子Per+/+的患者有36名，占乳腺癌患者的9.3%，略高于正常人中的6.5%。他们又将乳腺癌患者分为绝经期及绝经后2个阶段，进一步分析发现绝经前乳腺癌患者中基因型为Per3+/+和Per3+/-的患者比例为62.5%，而正常妇女中仅为49%。在绝经后妇女中则未能发现明显差异。这也表明Per3基因的多态性与乳腺癌发生具有明显相关性，尤其是在绝经前的妇女中，大多数患者具有明显家族病史，这也可能与绝经前妇女相较于绝经后发病患者，其可能继承更多遗传风险因子有关。

2.4 Per家族基因与头颈部鳞癌的关系

头颈部恶性肿瘤是指从颅底到锁骨上、颈椎前这一解剖范围内的所有恶性肿瘤，一般不包括颅内、颈椎及眼内的恶性肿瘤。头颈部肿瘤病理类型较多，但大部分为鳞癌，占90%以上。 关于时钟基因与头颈部鳞癌关系的研究尚处于初级阶段。Hsu等[17]于2009年至2011年期间共收集了40例头颈部鳞癌标本，采用实时定量PCR法检测发现，癌组织中Per1、Per2、Per3、Cry2基因表达较正常组织表达下调，他们根据患者临床分期将Ⅰ～Ⅱ期分为一组，Ⅲ～Ⅳ期为一组，进一步分析发现，Per3基因的下调程度与肿瘤分期明显相关，Ⅲ～Ⅳ期患者中Per3基因下调程度明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者。而在关于Per基因同肿瘤大小的研究中，40例标本根据肿瘤直径是否超过3cm分为两组比较发现，Per3基因在肿瘤大于3cm组中其表达程度较小于3cm组明显下调。同时他们发现肿瘤浸润程度大于1cm的标本中Per3基因的表达量也明显低于肿瘤浸润程度小于1cm的标本。上述实验结果均具有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明，Per1、Per2、Per3基因表达均在头颈部鳞癌组织中出现了下调，但只有Per3基因同肿瘤的分期、大小、浸润程度具有明显相关性。在人口腔黏膜细胞Per1基因表达昼夜节律性的研究中，Bjarnson等[18]发现正常人口腔颊黏膜细胞中Per1mRNA的表达具有24h昼夜节律性，Per1mRNA表达峰值出现于活动相早期(07：58am)，谷值出现于活动相和休息相的转化时期(00:00am)，峰值比谷值高3.33倍(P<0.05)。而在进一步研究中，Zhao等[19]通过对口腔黏膜鳞癌组织的研究，发现Per1mRNA表达具有昼夜节律性并且发现调低Per1基因表达水平可增加肿瘤淋巴结转移的可能，这提示了Per1基因表达水平在抑制肿瘤转移中具有重要作用。Chen等[20]也在关于Per家族在口腔鳞癌表达水平的研究中发现，Per家族基因在癌组织中较正常组织表达量降低(P<0.05)。在牙龈癌的研究中，Hastings等[21]的一项研究表明Per1、Per2、Per3基因在牙龈组织及牙龈癌中均有表达，Per3基因在牙龈癌组织中的表达较癌旁组织明显下降(P<0.05)。进一步研究中，Sato[22]等选取了人类牙龈癌细胞系CA9-22与人类牙龈正常成纤维细胞，通过免疫组化、实时定量PCR法分析比较，发现Per1基因主要表达于细胞核中，其在正常牙龈成纤维细胞中表达水平显著高于人类牙龈癌细胞中的表达，而在另一方面，Per3基因则主要表达于细胞质中，在牙龈癌组织中表现为低表达。这提示Per1、Per3基因在牙龈癌细胞中具有抑制肿瘤发生发展的作用，其表达在肿瘤发展中相互独立。从上述研究中可以发现，Per家族基因表达水平在头颈部肿瘤组织中明显下调且其表达水平具有昼夜节律性，这也为后续头颈肿瘤研究开辟了一个新的探索途径。

3 Per家族基因同时辰放化疗之间关系的研究

化疗及放疗作为治疗肿瘤的主要治疗方式，其治疗效果已得到了广泛认同。随着对生物节律性研究的深入及时间治疗模式的提出，在此基础上逐渐出现了一种新的治疗模式—时辰放化疗。时辰化疗利用化疗药物作用于处于不同周期的肿瘤细胞起到杀灭肿瘤细胞的作用；在长期研究中发现正常组织与肿瘤组织在放射敏感性方面具有生物节律差异，时辰放疗即是选择肿瘤组织对射线敏感期放疗同时避开正常组织射线敏感期。根据生物的节律选择特定时间实行放化疗，可以达到最大化杀伤肿瘤细胞、减轻放化疗的相关毒副作用[23]。

化疗方面，国外学者Sato[22]等在顺铂治疗牙龈癌的研究中发现，将顺铂作用于牙龈正常成纤维细胞中，其Per1和Per3基因的表达量无明显变化。而经顺铂治疗后的牙龈癌细胞中Per1和Per3的基因较加入药物前明显增高，进一步研究发现，Per1表达量增高能协同顺铂共同作用于牙龈癌细胞降低牙龈癌细胞的生存能力，并且他们发现加入顺铂的正常成纤维细胞中，Per3基因表达较高的成纤维细胞其生存能力较强，这些结果表明Per1、Per3基因能协同顺铂共同作用于肿瘤细胞，降低肿瘤细胞的生存能力，同时能增强正常细胞对顺铂的耐受程度从而减少正常细胞的死亡。Per家族基因作为时钟基因其表达水平具有明显昼夜节律性，以上研究提示我们，Per基因表达量的增高有助于提高牙龈癌的治疗疗效，而根据基因表达水平选择化疗药物给药高峰时间则是时辰化疗的核心内容。在治疗卵巢转移癌、肺癌、乳腺癌、白血病等疾病中，许多长期临床试验都证明时辰化疗相较于传统治疗方式具有更好的治疗效果及更轻的化疗毒副反应，尤其是对于仍然具有正常生物节律的患者[24-25]，而根据Per基因表达量的变化改变时辰化疗模式将在后期关于减轻患者化疗毒副反应同时提高患者疗效的研究中提供一种新的研究途径。

放疗方面，在昼夜节律基因对食管癌细胞株(Eca 109)放射敏感性影响的研究中，昼夜节律基因Perl和Per2表达高峰时照射与低谷时照射比较发现，肿瘤细胞凋亡率减少，说明昼夜节律基因Perl和Per2高表达，能够降低食管癌细胞的放射敏感性[26]，但体内研究得出了不同的结果。在最近一篇关于脑胶质瘤动物模型研究中，Niu[27]等测定出正常脑组织中Per1基因表达在早上8点到达高峰，之后逐渐下降，在20点至24点到最低谷；而胶质瘤中其表达高峰位于4点并在12点降至低谷。正常脑组织中Per2则于早上0点开始升高并于12点达到高峰，之后逐渐下降并于24点降至低谷，但胶质瘤中Per2基因于0点出现表达高峰并在8点降至低谷。研究者根据Per1基因昼夜变化节律于12点给予放射治疗，12点接受照射的动物其Per1基因表达水平明显高于未接受照射组；另一方面他们根据Per2基因的昼夜节律变化分别于0点、4点进行放射治疗，发现正常组织中治疗组与对照组其Per2基因表达水平无明显差异，而在胶质瘤组织中，治疗组Per2基因表达水平明显高于对照组。进一步研究发现胶质瘤组织中Per1、Per2基因表达高峰时进行放射治疗，其肿瘤细胞凋亡率明显高于Per1、Per2基因低表达时行放射治疗的胶质瘤组织，而这些实验结果也表明根据Per1、Per2基因的昼夜节律变化调整放射治疗时间能有效提高放射治疗疗效。

4 结 语

综上所述，随着对Per家族基因研究的不断深入，Per家族基因的调控作用及其在恶性肿瘤中的表现形式不断得到新的认识。时辰治疗的研究目前尚处于初步临床研究阶段，缺乏大量基础研究的支撑。而关于Per家族基因的研究，将对时辰治疗的理论研究提供一个新的探究思路。虽然目前Per家族基因同时辰治疗之间联系的研究尚处于初级阶段，但在肿瘤治疗模式逐步向个体化治疗转化的趋势下，这样的研究无疑将为肿瘤治疗提供一种新的治疗方向。

[1] Yagita K，Yamanaka I，Emoto N，et al.Real time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using To12 transposon-mediated gene transfer strategy[J].BMC Biotechnol，20l0，10(1)：1-7．

[2] Cermakian N，Boivin DB.The regulation of central and peripheral circadian clocks in humans[J].Obes Rev，2009，10(2)：25-36．

[3] Langmesser S，Tallone T，Bordon A，et al.Interaction of circadian clock proteins PER2 and CRY with BMALl and ClOCK[J].BMC Mel Biol，2008，9(1)：1-16．

[4] Magnone MC，Langmesser S，Bezdek AC，et al.The Mammalian circadian clock gene per2 modulates cell death in response to oxidative stress[J].Front Neurol，2015，5(13)：1-11．

[5] Bass J，Takahashi JS. Circadian integration of metabolism and energetics[J].Science，2010，330(6009)：1349-1354.

[6] National Cancer Institute.Surveillance，Epidemiology，and End Results Program[S/OL].Http:// seer.cancer.gov/statfacts/html/lungh.html#survival，2014-12-10.

[7] 陈万青，张思维，曾红梅，等.中国2010年恶性肿瘤发病与死亡[J].中国肿瘤，2014，23(1)：l-10．

[8] 池 闯，何志锋，刘 瑜，等.生物钟基因Per2在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义[J]．中华肿瘤杂志，2013，35(2)：129-131.

[9] Mazzoccoli G，Panza A，Valvano MR，et al．Clock gene expression levels and relationship with clinical and pathological features in colorectal cancer patients[J]. Chronobiol Int，2011，28(10)： 841-851．

[10]王雅平，华鲁纯，蒿汉坤，等．生物钟基因hPer2在人结直肠癌中的表达及其临床意义[J]. 中华实验外科杂志，2009，26(8)：1034-1036．

[11]Yang SL，Yu C，Jiang JX，et al. Hepatitis B virus X protein disrupts the balance of the expression of circadian rhythm genes in hepatocellular carcinoma[J]. Oncology Letters，2014，8(6)：2715-2720．

[12]Yu C，Yang SL，Fang X，et al．Hypoxia disrupts the expression levels of circadian rhythm genes in hepatocellular carcinoma[J]. Mol Med Rep，2015，11(5)：4002-4008．

[13]金 涛，刘 平，黄早早，等.乙肝病毒X 蛋白对正常肝细胞生物钟基因表达的影响[J]. 中国普通外科杂志，2014，23 (7)：915-920．

[14]Relles D，Sendecki J，Chipitsyna G，et al．Circadian gene expression and clinicopathologic correlates in pancreatic cancer[J]. J Gastrointest Surg，2013，17(3)：443-450．

[15]Winter SL，Bosnoyan CL，Pinnaduwage D，et al．Expression of the circadian clock genes Perl and Per2 in sporadic and familial breast tumors[J].Neoplasia，2007，9 (10)：797-800．

[16]Zhu Y，Brown HN，Zhang Y，et al．Period3 structural variation：a circadian biomarker associated with breast cancer in young women[J].Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，14(1)：268-270．

[17]Hsu CM，Lin SF，Lu CT，et al.Altered expression of circadian clock genes in head and neck squamous cell carcinoma[J].Tumor Biol，2012，33(1)：149-155.

[18]Bjarnson GA，Jordan RC，Wood PA，et al．Circadian expression of clock genes in human oral mucosa and skin：association with specific cell cycle phases[J]．Am J Pathol，2001，158(5)：1793-1801.

[19]Zhao N，Yang K，Yang G，et al.Aberrant expression of clock gene period1 and its correlations with the growth, proliferation and metastasis of buccal squamous cell carcinoma[J]. PLoS One，2013，8(2)：e55894.

[20]Chen R，Yang K，Zhao NB，et al．Abnormal expression of PER1 circadian-clock gene in oral squamous cell carcinoma[J].OncoTargets and Therapy，2012，2012(1)：403-407.

[21]Hastings MH，Reddy AB，Maywood ES，et al. A clockwork web：circadian timing in brain and periphery，in health and disease[J].Nat Rev Neuroscience，2003，4(8)：649-661.

[22]Sato F，Wu Y，Bhawal UK，et al.PERIOD1 (PER1) has anti-apoptotic effects，and PER3 has pro-apoptotic effects during cisplatin (CDDP) treatment in human gingival cancer CA9-22 cells[J]. Eur J Cancer，2011，47(11)：1747-1758.

[23]孙凤飞，胡 欣，朱家媛，等.肿瘤时辰治疗的研究进展[J]. 肿瘤预防与治疗，2010，23 (4)：346-349．

[24]Greene MW. Circadian rhythms and tumor growth[J]. Cancer Letters，2012，318(2)：115-123.

[25]Chapman JD，Reuvers AP，Borsa J，et al. Chemical radioprotection and radiosensitization of mammalian cells growing in vitro[J].Radiat Res，2012，178(2)：AV214-222.

[26]孙风飞，朱家媛，刘 康，等.昼夜节律基因hPerl和hPer2对食管癌细胞株Eca 109放射敏感性的影响[J].航天医学与医学工程，2011，24(5)：332-335.

[27]Niu ZF，Li YH，Fei Z，et al.Circadian genes Per1 and Per2 increase radiosensitivity of Glioma in vivo[J].Oncotarget，2015，12(6)： 9951-9958.

2016- 03- 18

2016- 07- 20

*国家自然科学基金项目(81560437)

王 睿(1989-)，男，侗族，四川乐山人，硕士，医师，主要从事头颈部肿瘤基础与临床研究。

△金 风(1963-)，主任医师，教授，硕士生导师，E-mail ：jinf8865@yeah.net

R73

A

10.3969/j.issn.1674- 0904.2016.04.007