景晟（上海复星长征医学科学有限公司 上海 200444）

自制5’-核苷酸酶试剂在生化检验中的应用

景晟*
（上海复星长征医学科学有限公司 上海 200444）

摘 要目的：评价自主研发的5’-核苷酸酶试剂（速率法）在自动化检测血清或血浆中5’-核苷酸酶活性的应用。方法：采用奥林巴斯AU680全自动生化分析仪，通过重复性、线性试验、测定血清或血浆中5’-核苷酸酶活性，进行方法学评价并与美国Diazyme 5’-核苷酸酶试剂（速率法）比较。结果：两个水平质控中酶活性的变异系数（CV）分别为2.83% 和1.96%，在 5～200 U/L酶活范围内，线性良好。两种试剂测定血清5’-核苷酸酶活性的相关系数较好，相关系数r 为0.995。结论：自主研发的5’- 核苷酸酶试剂盒操作简便、快速、准确、稳定，结果准确，可满足大批量临床样本的常规和自动化分析，是一种值得推广的方法。

关键词5’-核苷酸酶 诊断试剂 临床研究

The application of the homemade 5’-nucleotidase reagent in biochemical analysis

JING Sheng*
(Shanghai Fosun Long March Medical Science Co. Ltd., Shanghai 200444,China)

ABSTRACTObjective: To evaluate the application of the independent innovation reagent in the automatic determination of 5’-nucleotidase (5’-NT) activity in the clinical serum or plasma samples. Methods: 5’-NT activities were determined with Olympus AU680 automatic biochemical analyzer by repeatability and linearity tests, the evaluation of methodology was carried out and the results were compared with those determined by the reagent of Diazyme Laboratories. Results: The coefficients of variation (CV) of the enzyme activity at two levels of quality control were 2.83% and 1.96%. The determination of enzyme activity showed a good linearity over the range of 5~200 U/L. There was a good correlation between two reagents (r=0.995). Conclusion: The 5’-nucleotidase reagent made by our company can provide a simple, quick, accurate and stable method for the determination of 5′-NT activity in the clinical serum or plasma samples and meet the requirement of the automated analysis of mass clinical samples. This method may be worthy of promotion.

KEY WORDS5’-nucleotidase; clinical research; diagnostic reagent

1934年Reis第一次描述了心脏和骨骼肌中5′-核苷酸酶（EC3.1.3.5）的活性[1]。它的主要功能是将核苷酸5′-C上连接的磷酸催化水解生成核苷和正磷酸，其在细胞生长发育、运动、纤维蛋白合成、神经传递、淋巴细胞的黏附、再循环、免疫应答等方面发挥重要作用及在缺血性心脏病、缺血性肾脏病、白血病、肿瘤等疾病的发生和发展过程中的作用越来越受到人们的重视[2-4]。目前测定5′-核苷酸酶活性的方法有很多，包括钼蓝显色法[5]、Kalckar 氏法[6]、改进的Kalckar 氏法[7]、酶法[8]和速率法[5]。其中钼蓝显色法和速率法是最常用的方法，但是钼蓝显色法所需试剂种类多，操作繁琐、费时，不适宜自动化分析；速率法通常须采用昂贵的进口试剂，而大部分国产5′-NT试剂只能用于血清样本的检测。本文采用复星长征试剂测定血清或血浆中5′-核苷酸酶的活性，并对其进行方法学评价。

1 材料与方法

1.1 仪器

日本 Olympus AU680 全自动生化分析仪。

1.2 试剂、校准品和质控品

复星长征自主研发5'-NT试剂（批号为D20130703，简称复星长征试剂）；对照试剂（批号为 8746）、校准品（批号为NTS001120）、配套质控品1（批号为NTC101310）和配套质控品2（批号为NTC201310）均购自美国Diazyme公司。

1.3 标本

本研究收集的标本为上海复星长征公司医学科学有限公司员工的100人，静脉采血，样本新鲜无溶血、无黄疸。同一份样本各采两管血，一份血清样本一份肝素血浆样本。

1.4 测定方法及条件

按照以下参数来设置奥林巴斯AU680全自动生化分析仪：

速率法：温度37 ℃，主波长546 nm，副波长800 nm，吸光度范围0～2 A，比色杯光径1.0 cm，反应方向为吸光度上升的反应，样本用量6 µl，复星长征试剂和Diazyme试剂均为液体双试剂，分别由试剂1（R1）和试剂2（R2）组成。R1用量225 µl，孵育时间5 min；R2用量75 µl，延迟时间120 s，测定时间120 s，校准模式为两点定标。

1.5 空白吸光度

用试剂（盒）测试生理盐水，记录试剂（盒）参数规定读数点546 nm下的吸光度值（A），重复两次。

1.6 重复性

在重复条件下，测试5′-NT活性标示值分别为28.3 U/L和141.2 U/L的控制血清，将这两水平控制血清分别测试10次，计算测量值的平均值（x）、标准差（s）和变异系数（CV）。

1.7 线性试验

用接近线性范围下限的低活性样品与接近线性范围上限的高活性样品混合配制成5、12.5、25、50、100、200 U/L的6个样品（xi），分别用测试试剂（盒）对各样品进行测试，每个样品测试3 次，分别求出每个活性浓度样品检测结果的均值（yi）。以6个浓度（xi）为自变量，以检测结果均值（yi）为因变量作线性回归。

1.8 血清和血浆测定结果比较

100人份的血浆和血清样本同时检测5’-NT活性，并比较测定结果。

1.9 复星长征试剂与Diazyme试剂的对比试验

随机选择50份样本，每份样本作双份测定，取均值，按NCCLS EP9[9]的评价方案统计结果。

2 结果

2.1 空白吸光度

三次试剂空白的检测结果分为0.016 7，0.017 2，0.015 9，试剂的空白变化率的检测结果分别为0.001，0.000 8，0.000 9，结果表明试剂空白小于0.5，试剂的空白变化率小于0.005，检测结果符合产品注册标准，试剂性能可控。

2.2 重复性

低、高活性两个水平质控中酶活性的平均值分别为27.8 U/L和139.6 U/L，变异系数（CV）分别为2.83% 和1.96%，均小于5%。试剂的重复性检测结果符合产品注册标准，试剂性能可控。

2.3 线性试验理论值(x)与测定值(Y)之间的线性回归

所得数据的线性回归方程为Y=0.987 6 X-0.746 2，R=0.999 9，5′-NT酶活浓性在5～200 U/L范围内线性关系良好。

2.4 血清与血浆标本5′-NT测定结果比较

复星长征公司试剂对血清和血浆中5′-NT活性的检测结果的均值为3.85 U/L和3.81 U/L，两者差异无显著意义（t=0.23，P>0.05），血清和血浆测定结果之间具有良好的相关性（r=0.999，图1）。

图1 复星长征试剂测定血清和血浆中5′-NT活性

2.5 复星长征试剂（速率法）与Diazyme试剂的比对以及偏倚评估

Diazyme公司试剂和复星长征试剂对100例血清5′-NT活性检测的均值分别为3.97 U/L和3.85 U/L，两者无显著差异（t=0.23，P>0.05），所测5′-NT活性具有良好的相关性（r=0.995，图2）。两方法均值相对偏差的偏置曲线图可以看出两种试剂检测同一样本的相对偏差结果良好，部分样本的相对偏差绝对值虽然超过15%，但都集中在4 U/L以下，这可能是由于样本浓度极低、试剂以及机器的系统偏差所致；另一方面，参考值为0～11 U/L，低于该值的样本不影响结果的判断。显示两种试剂测定单个样本偏差较小，分布较合理。

图2 Diazyme试剂和复星长征试剂测定血清样本中5′-NT活性

3 讨论

5′-NT广泛存在于肝脏和各种组织中。血清中5′-NT活性增高主要见于肝胆系统疾病，如阻塞性黄疸、原发及继发性肝癌等，通常酶活性变化与碱性磷酸酶（ALP）活性变化相平行。但在骨骼系统疾病中，如肿瘤骨转移、畸形性骨炎等疾病中ALP活性增高，而5′-NT活性正常。所以，对ALP活性增高的患者，测定5′-NT活性有助于临床判断ALP活性增高原因是肝胆系统疾病，还是骨骼系统疾病[5]。

周永年等[10]研究发现在肝胆发生病变时其释放的5′-NT经胆汁酸作用后进入血液循环，使血清中的5′-NT活性升高。故血清中5′-NT活性的变化较少受到肝外其他疾病的影响，有助于临床鉴别诊断。刘新等[11]研究表明，当肝胆疾病发生时，5′-NT活性升高的同时丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、谷氨酸转肽酶（GGT）、ALP活性亦见增高，其增高程度与病情的严重度密切相关。

复星长征试剂可检测血清和血浆样本的5′-NT活性，并且血清和血浆测定结果之间具有良好线性相关性；与Diazyme公司试剂所测5′-NT活性也具有良好的线性相关性。表明采用我公司自制试剂进行5′-NT活性测定的方法操作简单、线性范围宽、重复性好、结果准确，完全可以替代美国Diazyme公司的5′-NT试剂应用于血浆和血清中5′-NT活性测定。

参考文献

[1] Reis MJ. Nucleotidase and its relation to the deamination of nucleotides in the heart and the muscles[J]. Bull Soc Chim Biol, 1934, 16: 385-399.

[2] Airas L, Niemelä J, Salmi M, et al. Differential regulation and function of CD73, a glycosyl-phosphatidylinositol-linked 70-kD adhesion molecule, on lymphocytes and endothelial cells[J]. J Cell Biol, 1997, 136(2): 421-431.

[3] Resta R, Yamashita Y, Thompson LF. Ecto-enzyme and signaling functions of lymphocyte CD73[J]. Immunol Rev, 1998, 161: 95-109.

[4] Moriwaki Y, Yamamoto T, Higashino K. Enzymes involved in purine metabolism-a review of histochemical localization and functional implications[J]. Histol Histopathol, 1999, 14(4): 1321-1340.

[5] 王毓三, 王继贵. 第四篇临床化学检验[M]//叶应妩, 王毓三, 申子瑜. 全国临床检验操作规程. 3版. 无锡: 东南大学出版社, 2006: 436-438.

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[8] 张晋会. 血清5'-核苷酸酶测定方法的建立和临床应用[J].医学信息, 2011, 24(5): 276.

[9] Krouwer JS, Tholen DW, Garber CC, et al. Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples Approved Guideline-Second Edition[EB/ OL]. [2014-12-20]. http://yeec.com/uploadimages1/ forum/2009-7/20097251016576037.pdf.

[10] 周永年, 李晋. 5'-核苷酸酶在肝胆系统疾病中的应用[J].山西医药杂志: 下半月, 2010, 39(11): 1109-1110.

[11] 刘新, 传良敏, 邓君, 等. 5'-核苷酸酶在肝脏疾病诊断中的应用[J]. 淮海医药, 2006, 24(2): 98-99.

收稿日期：（2014-07-30）

作者简介：*景晟（1980-），男，工程师，生化研发经理，从事于体外诊断试剂生化试剂的研发。E-mail: jingsh@ fosunpharma.com

中图分类号：R981; R446.112

文献标识码：A

文章编号：1006-1533(2015)01-0030-03