韩　伟，满　宁

(华东理工大学 药学院 中药现代化工程中心，上海　200237)



HD-8阳离子交换树脂纯化灰树花多糖及其抗氧化活性的研究

韩伟，满宁

(华东理工大学 药学院 中药现代化工程中心，上海200237)

摘要：以脱蛋白率、脱色率和多糖保留率为指标，筛选出灰树花多糖纯化效果较佳的阳离子交换树脂HD-8，并对其纯化工艺进行考察，获得优化的工艺条件为：流速2 BV/h(1 mL/min)、上样量400 mL(蛋白质含量为99.2 mg)、上样的量做浓度0.248 mg/mL(多糖提取液中蛋白质浓度)，多糖纯度达62.66%.与其他工艺相比，采用HD-8树脂能有效地提高灰树花多糖的纯度且节约成本、操作高效；同时对灰树花多糖的体外抗氧化活性进行了评价.

关键词：灰树花；多糖；树脂；抗氧化

灰树花(Grifolafrondosa)，又称舞茸、莲花菇、栗子蘑等，属担子菌亚门，层菌纲，多孔菌科[1]，从温带到亚热带森林均有分布，在我国和日本被广泛栽培，是一种好氧喜光的大型木腐真菌.灰树花形态如莲花似珊瑚，肉质脆嫩，鸡丝香味[2]，具有极高的营养价值和多种药理疗效，是近年来热点研究开发的珍奇真菌之一.灰树花的主要生物活性成分有多糖、多酚、核酸、蛋白质、脂类等[3]，还富含多种氨基酸、维生素、矿物质和有机酸，膳食纤维高达33.7%[4].其中灰树花多糖具有抗肿瘤，抗HIV病毒，增强免疫功能，调节血压、血糖和血脂等生物功能[5]，在医疗和保健方面具有很高的开发利用价值及良好的应用前景.

多糖的脱蛋白纯化方法一般有Sevage法、醇沉法、三氯乙酸法等[6].这些纯化方法存在有机试剂用量大、操作时间长、效果差等缺点.本文以灰树花子实体为研究体系，脱蛋白率、脱色率、多糖保留率为指标，采用动态法筛选出纯化效果较佳的HD-8阳离子交换树脂，并对其操作工艺参数进行优化；最后选用羟自由基法[7-8]对纯化后的灰树花多糖进行体外抗氧化活性评价.

1实验部分

1.1实验原料与试剂

灰树花，真菌干品，上海市农业科学院；葡萄糖(标准品>95%)，硫酸，苯酚，醋酸，抗坏血酸(VC)，过硫酸钾(KS2O4)，过氧化氢(H2O2，质量分数30%)，水杨酸，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；七水合硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 和无水乙醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白(标准品>98%)，BR，上海源聚生物科技有限公司；壳聚糖，分析纯，上海伟康生物制品有限公司.

树脂：大孔吸附树脂HZ803、HZ806、HZ816、HZ820，大孔型离子交换树脂D202、D301、D001、DK110、HD-8，凝胶型离子交换树脂711(201×4)、335、732，选购于上海华震科技有限公司.

1.2实验仪器

紫外-可见分光光度计(UV1900PC，上海亚研电子科技有限公司)，集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S，巩义市英峪予华仪器厂)，循环水真空泵(SHB-Ⅲ型，巩义市英峪予华仪器厂)，旋转蒸发器(RE-52C，上海予华仪器有限公司)，微波炉(ER-692型，中国电子器件工业总公司)，电子天平(AL104，梅特勒托利多)，超声波清洗器(SK3310HP，上海科导超声仪器有限公司)，台式高速离心机(RJ-TGL-16C，无锡市瑞江分机仪器有限公司).

1.3分析方法

1.3.1多糖质量的测定方法

最大吸收波长的确定：采用苯酚-硫酸法[9]进行显色反应，在400～600 nm范围内进行波长扫描.根据扫描结果，确定489 nm作为检测波长.

葡萄糖标准曲线的建立：分别量取0.1 mg/mL葡萄糖标准品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于25 mL具塞比色管中，补水至2 mL，按上述的苯酚-硫酸显色法于489 nm波长处测定吸光度.以葡萄糖标准品浓度C(mg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，得到线性回归方程：A=0.004 37+15.978 57C，R=0.999 67.利用该回归方程计算灰树花多糖样品溶液中多糖的含量M=n×C×V，式中：C为样品中多糖的质量浓度(mg/mL)，V为溶剂量(mL)，n为溶液稀释倍数.

1.3.2蛋白质质量的测定方法

试剂的配制：精确称取20 mg牛血清蛋白，去离子水溶解，定容至100 mL容量瓶，即得0.20 mg/mL蛋白质标准溶液；精确称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶解于50 mL 95%乙醇，再加入100 mL 85%磷酸，去离子水定容至1000 mL，静置一段时间，过滤，滤去不溶物即得.

蛋白质标准曲线的建立：采用考马斯亮蓝G-250染色法[10]，分别精密量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL蛋白质标准溶液于25 mL具塞比色管中，补水至1.0 mL，分别加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，静置5 min，于595 nm[11]波长处测定吸光度.以蛋白质标准溶液质量浓度C(mg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制蛋白质标准曲线，线性回归方程为：A=4.800 76C+0.029 08，R=0.999 01.利用方程计算得到蛋白质质量N=C×V×100%(mg)，式中：C为溶液中蛋白质的质量浓度，V为溶液体积(mL).

1.3.3多糖保留率、脱蛋白率、脱色率、多糖纯度及自由基清除率的计算公式：

式中：M1为过柱前多糖质量 (mg)，M2为过柱后多糖质量 (mg).

式中：N1为过柱前蛋白质质量 (mg)，N2为过柱后蛋白质质量 (mg).

式中：A1为过柱前溶液的吸光度值，A2为过柱后溶液的吸光度值.

式中：C0为灰树花多糖溶液中多糖的浓度(mg/mL)，V0为灰树花多糖溶液体积(mL)，M为溶液浓缩后的干膏质量 (mg).

式中：K为样品溶液对自由基的清除率，A0为去离子水代替样品溶液反应的吸光度，A1为样品溶液清除自由基反应液的吸光度，A2为去离子水代替H2O2溶液反应的吸光度.

1.4实验方法

1.4.1灰树花多糖的树脂纯化

1)将灰树花粉碎，选用粒径范围10～20目，液固比20 mL/g，在pH为4.71左右的去离子水中微波提取240 s(输出功率为650 W，微波频率为2450 MHz).提取液冷却至室温后，进行称重补水，再抽滤，即制备得灰树花多糖提取液.

2)树脂的预处理

大孔吸附树脂：首先用去离子水反复浸洗树脂，直至浸洗液无泡沫；再将其用95%乙醇浸泡24 h，之后用去离子水冲洗至无乙醇气味，然后用去离子水浸泡备用.

阳(阴)离子交换树脂：将树脂用去离子水反复浸洗，直至浸洗水澄清无褐色为止；再用1 mol/L 的NaOH溶液(1 mol/L盐酸溶液) 浸泡，量为树脂体积的4倍，24 h后用去离子水冲洗，直至浸泡水pH值为6～7；然后用1 mol/L盐酸溶液(1 mol/L 的NaOH溶液)浸泡，量为树脂体积的4倍，浸泡24 h后，用去离子水浸洗至pH值为7左右，即可投入使用.

3)装柱：将预处理过的树脂进行湿法装柱，在层析柱内(1.5 cm×50 cm)注入一定量去离子水，赶走空气；再准确称取20 g树脂，加入去离子水混合至适宜稠度，灌注入层析柱内，使其自由沉降；沉降结束形成树脂床层后，静置过夜，备用.

4)树脂柱活化：实验前，将100 mL左右的去离子水以适宜的流速流过树脂柱，重复操作3遍，即可上样使用.

5)上样：取适量灰树花多糖提取液，以一定的流速流过活化后的树脂柱，收集流出液，即为纯化后的灰树花多糖提纯液.流速考察范围取1～5 BV/h；上样量取200、250、300、350、400、450、500 mL；上样浓度分别取上样液体积的0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50倍.

6)按“1.3”项的分析方法计算脱蛋白率、脱色率、多糖保留率及纯度.

1.4.2灰树花多糖的絮凝纯化和醇沉工艺

研究中还考察了絮凝和醇沉工艺纯化灰树花多糖的效果，方法如下：

1)絮凝纯化法

精密量取一定量的灰树花多糖提取液，按1.0 mL/g (絮凝剂体积/药材质量) 加入絮凝剂(1%壳聚糖乙醇试剂)，液药比40 mL/g，药液pH为6，温度控制在45 ℃；磁力搅拌1 h，离心15 min(5000 r/min)，取上层澄清液，即为絮凝纯化后的灰树花多糖溶液.将纯化后多糖溶液浓缩至膏状，烘干称重，测定多糖和蛋白质含量，计算多糖保留率、脱蛋白率和纯度.

2)醇沉工艺

精密量取多糖提取液和无水乙醇，混合使乙醇体积分数保持在80%左右，静置24 h，离心，沉淀用无水乙醇、丙酮分别洗涤3次，80 ℃干燥12 h，称重.测定计算多糖保留率、脱蛋白率和纯度.

1.4.3灰树花多糖的抗氧化活性研究

1)反应试剂的制备

①灰树花多糖溶液：按照“1.4.1”项(1)中方法提取灰树花多糖，再采用本文优化的HD-8阳离子交换树脂纯化工艺制备灰树花多糖(PGF1)，按“1.4.2”项中的壳聚糖絮凝纯化法制备灰树花多糖(PGF2).

②精密配备10 mg/mL的VC试剂(实验中稀释至不同浓度使用)，2 mmol/L FeSO4溶液，6 mmol/L H2O2溶液，6 mmol/L水杨酸溶液.

2)羟基自由基法

精密量取1 mL灰树花多糖溶液，置于具塞比色管中，加入1 mL FeSO4溶液，再加入1mL H2O2溶液，摇匀，静置15 min，然后加入1 mL水杨酸溶液，摇匀并开始记时，在510 nm波长处测定吸光度，从第2 min开始，每隔1 min记录1次，直至吸光度读数趋于稳定.按公式计算清除率，选用VC作为阳性对照组，VC试剂对OH·的清除反应操作同上.

根据样品溶液对OH·清除率随时间变化的结果，确定VC、PGF1和PGF2组分别静置反应的时间.进而考察不同浓度的样品溶液对羟基自由基的清除率.

2结果与分析

2.1树脂筛选

按“1.4.1”项的实验方法，对各类型树脂的动态吸附纯化效果进行考察，以脱蛋白率、脱色率及多糖保留率为指标，综合考虑树脂吸附杂质 (蛋白质、色素) 的能力及多糖的损失情况，结果见表1.

表1可以看出：在相同的动态吸附除杂条件下，不同种类、极性、酸碱性、粒径和含水量的树脂对蛋白质、色素、多糖的吸附能力不同，即对多糖中蛋白质和色素的脱除及多糖保留效果有差别.大孔型阳离子交换树脂HD-8、D001、凝胶型阳离子交换树脂732的脱蛋白率和多糖保留率均在90%以上，脱色率也较高，多糖纯度均达60%.其中阳离子交换树脂HD-8纯化效果最佳，多糖纯度为61.78%.因此，本文选择阳离子交换树脂HD-8脱除灰树花多糖中的杂质，同时对其纯化工艺做进一步研究.

表1　动态筛选结果

2.2HD-8型阳离子交换树脂的纯化工艺

2.2.1流速的考察

通常情况下，当流出液的蛋白质质量浓度为上样液中蛋白质质量浓度的10%时，认为树脂吸附蛋白质饱和，即树脂脱除多糖溶液中的杂质蛋白达终点.此时，将收集的流出液体积称之为泄漏点[12-13].本实验以脱蛋白效果为指标，考察HD-8阳离子交换树脂纯化工艺的适宜流速.

从图1可以看出，流速为1 BV/h时，流出液中蛋白质浓度增加最为缓慢，泄漏点出现最迟，随着流速增大，泄漏点开始提前，脱蛋白效果变差.这是因为流速加快，溶液中蛋白质与树脂接触不充分，导致树脂不能有效吸附杂质蛋白，故流出液中蛋白质浓度增加，树脂脱蛋白效果变差.因此，应该选择较慢的流速，有利于树脂充分吸附杂质蛋白.由于1 BV/h流速在处理相同体积上样液的时间是2 BV/h流速的两倍，综合考虑工艺的便捷、效率、成本及纯化效果，选取动态纯化过柱流速为2 BV/h.

2.2.2上样量的考察

从图2可以看出，在流速和上样浓度相同的条件下，HD-8阳离子交换树脂对多糖溶液的脱蛋白率随着上样量的增加先缓慢降低，上样量超过400 mL时，脱蛋白率显著下降；多糖保留率随上样量的增加不断增大；这主要是因为随着上样量的增加，树脂不断吸附上样液中的杂质蛋白，从400 mL左右开始，对蛋白质的吸附量逐渐趋于饱和，继续增加上样量，则脱蛋白率显著下降，脱蛋白效果变差.同时，树脂对多糖亦具有一定的吸附作用，不断增加上样量，吸附效果逐渐达饱和，对多糖的吸附率不断下降，故流出液中多糖保留率不断增大.综合考虑脱蛋白率和多糖保留率对纯化效果的影响，选择上样量为400 mL，经测定，其中蛋白质质量为99.2 mg.

图1　不同流速对树脂HD-8脱蛋白效果的影响

图2　不同上样量对树脂HD-8纯化效果的影响

2.2.3上样质量浓度的考察

由图3可知，当流速与上样量相同时，随着上样液体积倍数增大，即上样质量浓度减小，脱蛋白率增大，多糖保留率逐渐下降.这是因为上样液质量浓度较小时，单位体积内的蛋白质含量较低，与树脂表面接触更充分，有利于树脂对蛋白质的吸附，脱蛋白率较大；同理，上样液质量浓度较小时，树脂对多糖的吸附也更充分，则多糖保留率较低.由于从1.00倍开始，脱蛋白率上升缓慢，而多糖保留率下降较明显，故选取1.00倍，经测定，该多糖溶液中蛋白质的浓度为0.248 mg/mL，即最佳上样浓度为0.248 mg/mL左右.

通过对以上三个因素的考察，获得HD-8型阳离子交换树脂动态脱蛋白纯化灰树花多糖的优化工艺为：流速2 BV/h(1 mL/min)、上样量400 mL(蛋白质含量99.2 mg)、上样质量浓度为0.248 mg/mL(多糖提取液中蛋白质的质量浓度)，多糖纯度达62.66%.

2.3不同纯化工艺的比较

将HD-8型阳离子交换树脂纯化法、壳聚糖絮凝纯化法、传统醇沉法的纯化结果进行比较，见表2.

表2　不同纯化工艺的比较

从表2可知，与传统的醇沉法、壳聚糖纯化法相比，HD-8阳离子交换树脂纯化效果最好，脱蛋白率和多糖保留率均大大提高，多糖纯度达62.66%，比醇沉法和壳聚糖絮凝法分别提高了36.75%、8.88%；且操作时间较醇沉法大大缩减.由此表明，HD-8阳离子交换树脂纯化工艺是一种高效省时的纯化方法.

2.4灰树花多糖的体外抗氧化活性研究

本文选用羟自由基法评价灰树花多糖的抗氧化活性，灰树花多糖清除OH·的研究结果如图4.

从图4可以看出，PGF和VC清除羟基自由基的反应在20 min左右，清除率均变化极为平缓，趋于平衡，故本研究中灰树花多糖溶液与VC清除羟基自由基的反应时间均选为30 min.

图3　不同上样质量浓度对树脂HD-8纯化效果的影响

图4　羟自由基清除率随时间变化曲线

图5　VC、PGF1和PGF2对羟自由基清除率的量效曲线

图5为VC、PGF1和PGF2对羟自由基清除率的量效曲线图.结果表明，阳离子交换树脂HD-8纯化与壳聚糖絮凝纯化制备的灰树花多糖对羟基自由基的清除活力存在一定的差异，同时清除率均较高，具有抗氧化作用效果.从图中可以看到，阳性对照组VC的质量浓度为2 mg/mL时，清除率KVC达最大，为99.81%；在0.5～2 mg/mL浓度范围，PGF2对羟基自由基的清除率KPGF2大于PGF1对羟基自由基的清除率KPGF1，浓度为2～6 mg/mL时，KPGF1大于KPGF2；5 mg/mL时KPGF2为44.66%，KPGF1为48.28%，6 mg/mL时，KPGF1可达55.11%，两者仍随浓度的增加呈不断增大的趋势.

3结语

1)以灰树花子实体多糖为研究对象，对12种不同类型树脂进行动态纯化研究，筛选出效果最好的HD-8阳离子交换树脂，多糖纯度达61.78%.

2)对HD-8树脂吸附进行工艺优化，得到优化的条件为：上柱流速2 BV/h，上样量400 mL，上样液浓度0.248 mg/mL，纯化后多糖纯度达62.66%.HD-8阳离子交换树脂动态纯化工艺与醇沉法、壳聚糖絮凝法相比，纯度高、操作时间短，除杂效果理想，避免了使用有机溶剂，树脂可循环再利用，工艺经济环保，适合连续化工业生产，具有开发应用价值.

3)以VC为阳性对照组，结果表明，在1～6 mg/mL浓度范围，PGF1、PGF2对OH·的清除率存在一定的差异；同时，PGF1和PGF2对OH·最大清除率均高达50%左右，表明灰树花多糖能有效清除羟基自由基，具有抗氧化方面的应用潜力，可以作为一种抗氧化真菌进行开发利用.

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(编辑崔思荣)

Study On the Purification and Antioxidant Activity in Vitro of Polysaccharides in

Fruiting Body ofGrifolaFrondosa(PGF) with Cation Exchange Resin HD-8

HAN Wei, MAN Ning

(Engineering Center for Traditional Chinese Medicine Modernization,

School of pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)

Abstract:Using removal rate of protein,decolorization ratio,and retention rate of polysaccharides as indexes, cation exchange resin HD-8 was screened out with good purification effect.Optimal parameters of HD-8 purification process were studied as follows:flow rate was 2 BV/h(1mL/min);sampling amount was 400 mL(protein content was 99.2 mg);sample concentration was 0.248 mg/mL(protein concentration in extracting solution); and the purity of polysaccharides was 62.66%.Compared with other methods,PGF purified by cation exchange resin HD-8 can greatly improve the purity with cost-saving,high efficiency.And the antioxidant activity in vitro of polysaccharides was evaluated as well.

Key words:Grifola frondosa; polysaccharides; resin; antioxidant activity

中图分类号：S985.4

文献标志码：A

文章编号：1674-358X(2015)04-0018-06

作者简介：韩伟(1968-)，男，江苏宝应人，教授，博士，博士生导师，主要从事天然产物的提取、分离及功能研究.

基金项目：国家自然科学 (20006003)；上海市科技兴农重点项目[泸农科攻字(2012)第2—9号]

收稿日期：2015-05-08