庞晓斌，王　琳，赵　艳，陈若芸，谢欣梅，杜冠华*

(1. 河南大学 药物研究所，河南 开封 475004；2. 青岛市市立医院，山东 青岛 266011；3. 中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所 国家药物筛选中心，北京 100050)

消栓通络有效成分组对脑缺血再灌注大鼠的神经保护作用

庞晓斌1，王琳1，赵艳2，陈若芸3，谢欣梅1，杜冠华3*

(1. 河南大学 药物研究所，河南 开封 475004；2. 青岛市市立医院，山东 青岛 266011；3. 中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所 国家药物筛选中心，北京 100050)

摘要：目的探讨消栓通络有效成分组(XECG)对脑缺血/再灌注大鼠的神经保护作用。方法采用线栓法阻断大脑中动脉(MCAO)建立大鼠脑缺血/再灌注(I/R)模型。缺血2 h，再灌注24 h时后，通过腹腔给予XECG(200、100、50 mg·kg-1) ，以脑梗死体积、脑含水量和伊文思蓝 (Evans Blue，EB) 法检测血脑屏障通透性等指标评价XECG对脑缺血的神经保护作用。结果XECG能显著降低缺血再灌注大鼠脑梗塞体积和血脑屏障通透性。结论XECG对脑缺血损伤有直接的神经保护作用。

关键词：XECG；脑缺血；梗死体积；血脑屏障

中图分类号：R743.3

文献标识码：A

文章编号：编号： 1672-7606(2015)01-0010-03

收稿日期：2014-09-12

基金项目：国家自然科学基金资助项目 (81273652)。

作者简介：庞晓斌(1973-)，男，河南洛阳人，博士，副教授，从事药效物质基础与作用机制研究工作。

通讯作者：*杜冠华(1956-)，男，山东滕州人，研究员，博士生导师，从事药物发现的理论和技术研究工作。

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect of effective components group of Xiaoshuantongluo(XECG) on ischemia/reperfusion (I/R) injury in rats. MethodsMiddle cerebral artery occlusion was adopted to establish the rat ischemia / reperfusion model. Healthy male adult Sprague Dawley rats were randomly divided into the sham operation group，the model group，the nimodipine (4 mg·kg-1) group, and high, middle and low dose XECG groups (200, 100, 50 mg·kg-1). Cerebral infarction volume and blood brain barrier permeability were respectively detected by TTC method and Evans Blue (EB) leakage. ResultsCompared with the I/R model group, XECG could significantly reduce the cerebral infarction volume and remarkably decreased blood brain barrier permeability. Conclusion XECG has obviously protective effect on Sprague Dawley rats after cerebral ischemia and reperfusion.

Protective effects of effective components group of Xiaoshuantongluo on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats

PANG Xiaobin1, WANG Lin1, ZHAO Yan2, CHEN Ruoyun3, XIE Xinmei1, DU Guanhua3*

(1.InstituteofPharmacy,HenanUniversity,Kaifeng,Henan475004,China；2.QingdaoMunicipalHospital,Qingdao,Shandong266011,China；3NationalCentreforPharmaceuticalScreening,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Key words: XECG; cerebral ischemia; infarction volume; blood brain barrier

脑缺血(中风)是临床常见病，具有高发病率、高死亡率及高致残率的特点，严重危害着人类健康[1,2]。迄今为止，国内外在治疗脑缺血及其后遗症方面还缺少有效的治疗药物。因此, 寻找有效治疗药物具有重大意义。中医药对缺血性脑卒中的治疗有一定优势。消栓通络方是中医用于治疗中风后遗症的常用方剂，由川芎、丹参、黄芪、泽泻、三七等11味中药根据中医药理论配伍而成，具有活血化瘀、温经通络之功效[3,4]。消栓通络有效成分组 (the effective components group of Xiaoshuantongluo, XECG) 是从消栓通络方中经分离提取获得的多种有效成分组合，具有抑制血栓形成、改善脑血流、抑制血管内皮细胞损伤等功能[5-7]，但其对急性缺血性脑损伤的保护作用及其机制的研究还少有报道。本实验采用大脑中动脉内线栓法( middle cerebral artery occlusion，MCAO)建立大鼠脑缺血再灌注(ischemia / reperfusion，I/R)模型[8,9]，模拟人类缺血性脑中风病理过程，以脑梗死体积、脑含水量以及药物对血脑屏障(BBB)通透性的影响等指标评价XECG对脑缺血的神经保护作用。以期为XECG用于临床治疗缺血性脑中风提供实验依据。

1实验材料

1.1　实验动物

成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF级，体质量280～300 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号 SCXY( 京) 2012-0007。实验过程中大鼠的饲养环境稳定，室温(25±2) ℃，相对湿度(55±5) %，灯光控制12 h昼夜交替。对实验动物的所有操作均符合中国实验动物伦理学的要求。

1.2　药物与试剂

消栓通络有效成分组(XECG)(中国医学科学院药物研究所陈若芸研究员提供)；尼莫地平片(山西亚宝药业集团股份有限公司，批号 100702)；氯化-2，3，5-三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)，伊文氏兰 (EvansBlue，EB)购自Sigma 公司。

1.3　主要仪器

显微镜 SZX16型 ( 日本 Olympus 公司)；冰冻切片机(莱卡，德国)。

2方法

2.1　实验动物分组及处理

成年健康雄性SD大鼠，随机分为假手术组、缺血再灌注模型组、尼莫地平给药组(4 mg·kg-1)、XECG高、中、低剂量组(200，100，50mg·kg-1)，每组10只。各组手术后通过腹腔给药方式给药，假手术组和模型组给予等量生理盐水。

2.2　大脑MCAO法建立大鼠脑缺血/再灌注(I /R )模型

SD大鼠术前12 h禁食，质量分数为10%水合氯醛(350 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，仰卧位固定。参照Longa等[10]的大脑中动脉线栓法，造成左侧大脑中动脉阻塞。缺血2 h后，将栓线向外拉出至颈内实现再灌注。假手术组只进行术前麻醉和血管分离术，不结扎及导入线栓。

2.3　脑梗死体积的测定

各组取再灌注24 h后的大鼠3只，以质量分数为10%水合氯醛 (350 mg·kg-1体重)行腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，经心脏灌流生理盐水固定。断头取脑，迅速将取出的脑组织置于-20 ℃冰箱，10 min后置室温环境，将脑从额极至枕叶连续冠状切面，厚约2 mm，共5层。然后迅速将脑片置于5 mL体积分数为2 % 的TTC溶液中，37 ℃恒温、避光孵育 30 min，然后置于体积分数为4%多聚甲醛溶液，4 ℃固定，数码相机拍照，应用图像分析系统软件处理计算脑梗死体积。经TTC染色后，正常组织呈玫瑰红色，梗死组织未被染色而呈白色。

2.4　大脑含水量测定

于再灌注24 h后将大鼠断头取脑，将左右脑分别置于预先称重的试管中，称取大脑湿重，110℃ 恒温烘干箱中烘烤72 h，称干重，按下述公式计算脑水含量：脑含水量(% )=(湿重-干重)/湿重×100%。

2.5　血脑屏障通透性检测

各组取大鼠3只，手术后(给药后)即刻由尾静脉注射体积分数为2%伊文思蓝(EB)2 mL。再灌注24 h后，快速打开胸腔并暴露心脏，从左心室灌注生理盐水直至流出无色液体，断头取脑，小心剥取右侧大脑半球，电子天平精确称量其湿重后，加入甲酰胺，于45 ℃的水浴箱孵育24 h，3000 r·min-1离心15 min，取上清液，于620 nm处测定吸光度。根据EB溶液标准曲线，计算EB的含量(μg·g-1脑重量)。

2.6　统计学方法

3结果

3.1　XECG对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积的影响

结果显示，脑缺血2 h再灌注24 h后，假手术组无脑梗死出现，模型组的脑梗死明显；与模型组相比，XECG各剂量组脑梗死体积明显缩小，见图1。

3.2　XECG对大鼠缺血侧脑组织含水量的影响

结果显示，模型组大鼠的脑含水量明显高于假手术组，差异极显著(P<0.01)。与模型组相比，XECG各剂量组及尼莫地平组均能够降低缺血大鼠的大脑含水量，XECG高、中剂量组与模型组相比，差异

显著，有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1　XECG对缺血大鼠的脑水含量的影响

注：与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05。

3.3　XECG对大鼠缺血侧脑组织血脑屏障通透性的影响

结果显示，与假手术组相比，模型组大鼠脑组织EB含量明显升高，差异显著(P<0.01)；与模型组相比，XECG各给药组大鼠脑组织EB含量明显降低,以XECG高剂量组减低最为显著(P<0.01)，见图2。

图2　XECG对脑缺血再灌注大鼠脑组织血脑屏障通透性的影响(±s，n=3)与假手术组、模型组比较**P<0.01；#P<0.05，##P<0.01。

4讨论

消栓通络方出自北京同仁堂传统秘方，是中医用于治疗中风后遗症的常用方剂。消栓通络有效成分组 (XECG) 是根据中药复方有效成分组学思想指导，从消栓通络方中经分离提取获得的多种有效成分组合[11]。本研究采用大脑中动脉内线栓法建立大鼠局灶性脑缺血模型，通过测定脑梗塞体积、脑含水量，考察了XECG对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，研究结果显示，XECG可显著减小脑梗死体积，减轻神经功能的损伤，并减轻脑水肿。

血脑屏障(BBB)介于血液与脑组织之间，是调控外周循环与中枢神经系统之间物质平衡的一道屏障，在生理情况下，BBB能阻止大多数化合物从血液进入脑组织，因此，BBB在维持中枢神经系统内环境稳定方面具有重要作用[12,13]。在脑缺血时，BBB的结构和功能发生改变，屏障作用受损，通透性增加，生理状态下不能通透的物质可透过BBB到达组织间隙，从而引起脑实质的进一步损伤和脑水肿[14,15]。了解BBB通透性的调控方法对于神经系统疾病的预防和治疗具有重要意义。通过尾静脉注射伊文氏兰(EB)，定量检测染料的渗出率的方法考察了XECG对BBB通透性的影响。结果表明，XECG各剂量组显著减少了染料的渗出率(P<0.05，P<0.01)。

终上所述，XECG对脑缺血大鼠具有明确的神经保护作用，该保护作用可能与其减轻BBB损伤的作用密切相关。关于XECG对BBB的作用机制我们将做进一步的研究探讨。

参考文献：

[1] 王国为,夏洁楠, 侯江淇,等.浅析“五精所并”理论与中风证治[J].中华中医药杂志,2014，28(8):2 436-2 439.

[2] 徐江华,胡慧,王宁.中风患者出院前自我管理效能感及其影响因素分析[J].现代中西医结合杂志,2014，12(19):2 160-2 162.

[3] 白海侠,严亚锋.消栓通络胶囊对急性脑缺血再灌注大鼠脑组织中NO和NOS的影响[J].河南中医, 2013,37(9):1 430-1 432.

[4] 贾清华.消栓通络胶囊治疗脑血栓60例[J].陕西中医, 2006,34(2): 178-179.

[5] 赵艳,于昕,时丽丽,等.消栓通络方有效成分组对大鼠急性血瘀模型的影响[J].药学学报,2012,59(5):604-608.

[6] 张冉, 戴瑛, 程新锐,等.消栓通络方有效成分组抗血栓作用及其机制研究[J].中成药, 2006,28(10): 1 479-1 481.

[7] 谢欣梅, 庞晓斌, 赵艳,等.消栓通络有效成分组对氧糖剥夺损伤原代培养神经元的保护作用[J].药学学报, 2014,61(8): 1 130-1 135.

[8] Bleilevens C, Roehl A B, Goetzenich A,et al.Effect of anesthesia and cerebral blood flow on neuronal injury in a rat middle cerebral artery occlusion (MCAO) model[J]. Exp Brain Res, 2013, 224(2):155-164.

[9] Lin Y, Zhang J C, Fu J,et al. Hyperforin attenuates brain damage induced by transient middle cerebral artery occlusion (MCAO) in rats via inhibition of TRPC6 channels degradation[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2013, 33(2): 253-262.

[10] 谭初兵, 高梅, 王洪庆,等.消栓通络方有效成分组的筛选研究[J].中药药理与临床, 2011,26(1): 75-78.

[11] Dominguez A, Suarez-Merino B, Goni-de-Cerio F. Nanoparticles and blood-brain barrier: the key to central nervous system diseases[J]. J Nanosci Nanotechnol, 2014,14(1):766-779.

[12] Mikitsh J L, Chacko A M. Pathways for small molecule delivery to the central nervous system across the blood-brain barrier[J]. Perspect Medicin Chem, 2014,16(6): 11-24.

[13] Zhao L X, Liu A C, Yu S W,et al. The permeability of puerarin loaded poly(butylcyanoacrylate) nanoparticles coated with polysorbate 80 on the blood-brain barrier and its protective effect against cerebral ischemia/reperfusion injury[J]. Biol Pharm Bull, 2013,36(8):1 263-1 270.

[14] Liu Y, Wang D, Wang H,et al. The protective effect of HET0016 on brain edema and blood-brain barrier dysfunction after cerebral ischemia/reperfusion[J]. Brain Res, 2014,1544:45-53.

[15] Suzuki T, Miyazaki Y, Ohmuro A,et al. Blood-brain barrier transport of an essential amino acid after cerebral ischemia reperfusion injury[J]. Acta Neurochir Suppl, 2013,118:297-302.

[责任编辑段金卯]