文婷婷， 王 洋， 利 站， 林 程， 关亚静， 胡 晋

（1.浙江大学农业与生物技术学院种子科学中心， 杭州310058；2.山东省种子管理总站， 济南250100； 3.浙江农林大学， 杭州311300）

豌豆作为世界第四大豆类作物，种植面积广，年产量高，是重要的人类食品和动物饲料。多年来有关豌豆种子的研究已广泛开展，主要是从豌豆种子的生理特性、萌发特性及种植品质等角度研究报道。但国内外对豌豆种皮的研究却鲜见报道。豌豆种皮作为种子的重要组成部分，是种子胚胎与外界环境间的重要生物屏障，在保护胚胎免受逆境危害、调控胚胎发育、决定种子休眠和萌发、种子品质等方面都起着重要的作用；同时，它也是种子吸收外界化合物的第1道屏障。种皮透性可控制种胚与外界间的水分、气体和养分的交换，对种子休眠、萌发、贮藏以及种子处理等具有重要的作用。已有研究表明，化学物质在种子中的渗透性与种皮结构及成分等密切相关。刘军等报道，红豆草和扁蓿豆在种皮结构上有差异，导致透水性不同［1］。孙群等通过测定硬实种子和非硬实种子种皮粉末中的粗纤维、Ca、Si含量的差异，发现硬实种子的种皮强度在很大程度上与粗纤维和Ca有关，粗纤维和Ca的大量积累增加了种皮的机械强度［2］。电镜和质谱技术的发展为种皮结构和成分的深入研究创造了条件，但是引起种皮透水性差异的许多机理尚不完全清楚。本研究应用扫描电镜观察种皮结构，显微化学鉴别法和红外光谱分析法鉴定种皮细胞壁成分，并借助能量色散型x射线荧光分析仪对种皮中矿物元素含量进行定量测定，旨在探索豌豆种皮结构及成分对种子透水性的影响，以期为提高种子透性和品质提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验选用3个豌豆品种的种子：丰优1号、甬苗豌豆和中豌3号。种子置于4℃冰箱贮藏备用。

1.2 方 法

1.2.1 扫描电镜观察种子种皮结构

种子预处理参考刘强等［3］和文婷婷等［4］的方法。种子用浓度为0.1mol／L，pH＝6.9的磷酸缓冲液（PBS）浸泡12h，于2.5%的戊二醛溶液中4℃固定过夜后用0.1mol／L PBS漂洗样品3次，每次15min。将种皮剥离，横切种脐，用1%的锇酸溶液固定样品1～2h后再用0.1mol／L PBS漂洗样品3次，每次15min。用50%、70%、80%、90%、95%5种浓度的乙醇溶液对样品依次脱水，每种浓度处理15min，再用100%的乙醇处理2次，每次20min，接着用乙醇与醋酸异戊酯的混合液（体积比为1∶1）处理样品30min后用纯醋酸异戊酯处理样品过夜。

对样品进行临界点干燥，离子溅射镀膜，扫描式电子显微镜（XL 30－ESEM，荷兰飞利浦公司）观察，拍照。

1.2.2 酸蚀豌豆种子吸水率的测定

用浓硫酸对种子分别处理0，5，20，40，60min，每处理3次重复，每重复50粒。酸蚀种子用清水冲洗并擦干表面浮水后称重。将酸蚀种子浸泡于蒸馏水中，并于2，4，6，8，10，12h后分别取样，擦干表面浮水，称重记录。

1.2.3 显微化学鉴别法鉴定豌豆种皮细胞壁成分

参考刘军等［1］的方法，取豌豆种皮分别在碘－氯化锌溶液、盐酸间苯三酚试剂和苏丹Ⅳ酒精饱和溶液中染色，观察并记录种皮横断面染色结果。

1.2.4 红外光谱分析法鉴定豌豆种皮细胞壁成分

豌豆种皮经液氮研磨成粉末状，采用红外光谱仪（AVATAR 370型，美国 Thermo Nicolet公司生产，光谱分辨率4cm－1，扫描信号累加32次）扫描观察。

1.2.5 种子饱和吸水率及皮壳率的测定

取豌豆种子，3次重复，每次100粒，称重后浸于蒸馏水中12h，取出种子，擦干表面浮水，称重记录。

种子皮壳率测定参照王瑞等［5］的方法，将样品用蒸馏水浸泡2d，小心去皮，皮和胚分别置于105℃烘箱中烘至恒重后称重。

皮壳率（%）＝皮重／（皮重＋胚重）×100%。

1.2.6 矿物元素含量测定

取3个豌豆品种种子种皮各3～4g，经液氮研磨成粉末状，每个品种3次重复。处理好的样品使用岛津能量色散型x射线荧光分析仪（可测元素范围为Al～U）进行元素含量测定。

1.2.7 统计分析

百分率数据根据y＝arcsin［sqrt（x／100）］进行反正弦转化，采用Statistical Analysis System （SAS）软件进行差异显著性（a＝0.05，LSD）分析。

2 结果与分析

2.1 豌豆种皮结构

经扫描电镜观察，豌豆种皮表面有角质层，并且呈网状，网眼由不规则多边形组成（图1a）。种脐处种皮表面粗糙，未观察到角质层，中央纵向有1条脐沟（图1b）。

豌豆种子种皮横断面结构可分为4层（图1c）。最外1层为角质层，是植物中一种蜡状高度复杂的脂肪性物质。角质层下面是栅栏层，由径向长形、栅栏状细胞镶嵌排列紧密连接而成［4］，厚度为84.4～102.9 μm。第3层结构为垫状物，结构致密，厚度为20.6～53.5μm。最下面是薄壁组织层，由薄壁细胞疏松排列而成，可使水分快速穿过。

豌豆种子过种脐种皮横断面可分为5层（图1d）。对列栅栏层，上下栅栏层厚度分别为27.4～40.4μm和42.6～61.3μm。对列栅栏层在靠近管胞结构处，逐渐变薄，直至消失。管胞结构（最厚可达441.0μm，最宽可达272.0μm）在横断面上呈椭圆形，孔隙较大且疏松，在脐沟（宽36.5μm）处直接暴露于空气。星状组织分布于管胞结构两侧，在靠近

图1 豌豆种皮结构扫描电镜照片

图2 不同酸蚀时间豌豆种子照片

图3 不同酸蚀时间豌豆种子种皮结构扫描电镜照片

管胞处最厚，厚度可达257.0μm。最下面一层为薄壁组织，厚度约为183.0μm。管胞结构、星状组织和薄壁组织较疏松，有利于水分的输送。

2.2 酸蚀对豌豆种子种皮的影响

豌豆种子随浓硫酸腐蚀时间延长，种子表面褐色斑点增多（图2）。

经浓硫酸腐蚀5min的豌豆种子，其种脐处表面几乎无裂缝（图3a），而酸蚀20，40，60min种子的种脐裂缝逐渐增多且脐沟加宽（图3c，e和g）。对于种皮横断面，浓硫酸腐蚀5min的豌豆种子几乎无裂缝（图3b），而随着酸蚀时间的增加，种子的栅栏层、星状组织、管胞结构以及薄壁组织逐渐遭到破坏（图3d，f和图3h）。

在每一个时间段豌豆种子的吸水率均为酸蚀0min＞酸蚀5min＞酸蚀20min＞酸蚀40min。酸蚀60min与酸蚀0min的种子在浸水2h后吸水率没有显著差异。但随着浸水时间的延长，酸蚀0min的种子吸水率迅速上升，吸水8h已达到96.58%，增速8.43%／h。而酸蚀60min的种子在浸水8h后吸水率为74.15%，增速仅为3.82%／h。

表1 不同酸蚀处理时间豌豆种子的吸水率

2.3 豌豆种皮细胞壁成分

豌豆种皮结构经碘－氯化锌溶液染色呈棕色，盐酸间苯三酚试剂反应染成桃红色，苏丹Ⅳ酒精饱和溶液染色呈紫红色。由此可推测豌豆种皮细胞壁中含有较多的纤维素、木质素和角质。

图4 豌豆种皮红外光谱图

红外光谱分析法鉴定细胞壁成分参照谢晶曦［6］、徐荣等［7］和张晓斌等［8］的分析方法。2 889.65cm 附近为饱和C－H键的特征吸收峰，主要是细胞壁中蛋白质、纤维素和果胶等成分（图4）。1 643.70cm 附近是细胞壁蛋白质上的C＝O（酰胺Ⅰ带）。1 538.72cm附近主要是蛋白质上N－H振动吸收峰（酰胺Ⅱ带）。1 261.73cm 附近是蛋白质酰胺 Ⅲ 带。1 430.89 和1 384.13cm附近属纤维素中甲基的特征吸收峰，1 055.28cm附近为纤维素糖链中C－C和 C－O键的吸收峰。613.90cm附近为含硫化合物或脂肪族硝基、亚硝基化合物。由此可知，豌豆种皮中主要含有纤维素、果胶、蛋白质等成分。

2.4 豌豆吸水率与皮壳率

丰优1号与中豌3号的饱和吸水率分别达到100.59%和101.35%，显著高于甬苗豌豆（表2）。3个豌豆品种的皮壳率不同，品种间存在显著性差异（表2）。皮壳率由高到低依次为中豌3号（8.76%）、丰优1号（7.78%）和甬苗豌豆（6.80%）。

表2 3个豌豆品种的吸水率和皮壳率

2.5 豌豆种皮中含碳化合物和矿物元素含量

不同品种种皮中含碳化合物和矿质元素含量存在一定差异（表3）。丰优1号的Ca元素含量显著高于中豌3号和甬苗豌豆，中豌3号的Fe元素显著高于丰优1号和甬苗豌豆，甬苗豌豆的K元素则显著低于丰优1号和中豌3号。

表3 3个豌豆品种种皮中含碳化合物和矿质元素含量（%）

2.6 豌豆种子皮壳率、含碳化合物及矿物元素含量与种子吸水率的相关性分析

对3个品种种子皮壳率、种皮中各成分含量和种子吸水率进行相关性分析，表明种子皮壳率与吸水率呈极显著正相关，相关系数为0.89（表4）。种皮中K、Fe与种子吸水率呈极显著正相关关系，相关系数分别为0.94和0.97。Ca元素与种子吸水率呈显著正相关关系，相关系数为0.70。含碳化合物、Sr元素与种子吸水率呈极显著负相关关系，相关系数分别为－0.94和－0.82。

表4 豌豆种皮中各成分与种子吸水率之间的相关系数

3 讨论与结论

3.1 豌豆种皮结构与种子透水性的关系

种皮纹理特征可稳定遗传，是植物长期系统进化的结果［9］，可用作物种鉴定指标，为分析不同物种的进化及亲缘关系提供可行性方法［10］。一个多世纪以前就有学者提出，种皮结构影响种子透性。影响种皮透性的因素主要位于种皮的角质层以及厚壁的栅栏层［11］。本研究扫描电镜观察种皮结构、酸蚀种子吸水率、鉴定种皮细胞壁成分只用了丰优1号种子的结果，其余2个品种具类似结果。

一般认为，种皮表面角质层是阻挡水分进入种子的第1道屏障，因为其结构致密，且由蜡质等疏水物质组成。其次，栅栏层结构坚硬致密，无细胞间隙，是水分进入的主要障碍。种脐处的特殊结构使它成为吸收水分的主要通道。种脐横断面结构中没有角质层，且脐沟处孔隙较大的管胞结构直接与空气接触，星状组织和薄壁组织也是排列疏松的结构，使得水分、化学物质的吸收以及空气的流通易于进行。

种子酸蚀处理的目的是得到种脐和种皮结构受损的研究材料。不同酸蚀时间处理豌豆种子发现，随酸蚀时间延长，种脐和种皮被破坏程度加深，各时间段种子吸水率基本都低于对照。Cai等对新鲜豌豆的收缩特性和复水特性进行研究发现，种皮不仅阻碍水分由内向外运动也阻碍水分由外向内运动［12］。完整的未经破坏的种子，其吸水的主要部位是种脐，且由于种皮完整不易失水，因而种子有较高的吸水率。而一旦种子的种脐和种皮均被破坏，水分进出种子的障碍被解除，种子更容易吸水，但失水同样加剧，最终导致吸水率下降。因此，种子种脐与种皮的完整性对种子吸水保水至关重要。

3.2 豌豆种皮细胞壁成分与种子透水性的关系

本研究表明，豌豆种皮细胞壁中主要含有纤维素、木质素、角质、蛋白质、果胶等成分。其中纤维素是植物细胞壁的主要组成成分，常伴生着木质素等其他物质，使细胞壁具有高强度和抗化学降解的能力。孙群等认为，粗纤维的大量积累增加了种皮的机械强度和不透水性［2］。木质素使细胞相连，增加细胞壁的抗压强度，强化植物组织。梁艳丽等认为，种皮中木质素含量影响着种皮的厚度及坚硬度［13］。角质是植物角质层的主要成分，而作为种皮最外侧的坚密的角质层，是妨碍水分渗入种内，造成种子硬实的重要原因之一［14］。

3.3 豌豆种皮皮壳率与种子透水性的关系

种皮是由珠被发育而来的套被状结构，包围在胚和胚乳之外，是种子的重要组成部分之一，具有保护种胚和吸水保水的作用［15］。通过将3个豌豆品种的皮壳率与种子吸水率作相关性分析表明，种皮确实对种子透水性产生影响。皮壳率越高，吸水率越高，表明种子透水性越好。

3.4 豌豆种皮中含碳化合物、矿物元素与种子透水性的关系

周劲松认为，Ca、Si、K、Mg等元素含量可能与种皮硬度有关［16］。孙群等认为，Ca元素的大量积累增加了种皮的机械强度，是硬实种子的特征之一［2］。本试验通过对3个豌豆品种种皮中各成分含量与种子吸水率作相关性分析表明，种皮中K、Fe、Ca元素的积累可能有利于豌豆种子的透水性，而种皮中含碳化合物和Sr元素的存在可能阻碍种子的透水性。由此可见，不同作物类型种子透水性的影响因素可能并不完全一致。

综上所述，豌豆种子的透水性受到多种因素的影响，涉及到种子的种皮结构、种皮成分、皮壳率等。种皮结构中角质层和栅栏层是阻碍水分进入的主要因素，种脐是水分进入种子的主要通道。种皮成分中纤维素、木质素、角质、含碳化合物和Sr元素的积累都会增加种皮的机械强度，从而降低种子的透水性，而种皮中K、Fe、Ca元素的积累可能有利于种子的透水性。此外，皮壳率越高，种子的透水性越好，且保持种子种皮完整性对种子吸水保水具有重要作用。

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