蔡 明， 张美艳， 牟 兰， 薛祝林， 岳信龙， 黄必志

（1.兰州大学草地农业科技学院， 甘肃 兰州730020； 2.云南省草地动物科学研究院， 昆明650212；3.中国农业大学动物科技学院， 北京100019； 4.云南农业大学动物科技学院， 昆明650201）

红三叶（Trifolium pratense L.）原产于欧洲西南部，又名三叶草、金菜花、红荷兰翘摇等［1－4］，是一种优质、高产、高效的放牧型优良牧草［5－8］。化感作用通常是植物在遭受外界干扰时，为了避免或者减缓干扰的一种自然竞争适应策略。红三叶对周围植物具有极强的化感作用，它会通过茎叶的挥发、淋溶及根系分泌等途径向环境中分泌出多种异黄酮类物质［9－10］，这些物质会对周边植物的生长发育起到抑制作用，从而实现自身种群的保护。许多学者对红三叶对其他植物的化感作用进行了大量研究［11－14］，但对自身化感影响的研究较少。近年来，随着连作障碍问题的频繁发生［15－18］，牧草化感物质对自身作用机制研究更显得极为迫切。

本试验为阐明红三叶对自身种子的化感作用机理，研究了红三叶叶片浸提液对自身种子发育（发芽率、发芽势、胚根长、下胚轴长）的影响，确定叶片浸提液是否对自身种子萌发具有化感影响及强度大小，以期为实现红三叶的优质高产提供理论依据。

表1 试验地概况

1 材料与方法

1.1 试验材料

供体植物和受体种子均为普通红三叶，采自云南省昆明小哨牧场。

1.2 试验地概况

1.3 试验方法

1.3.1 采样及浸提液制备

采集新鲜红三叶植株，置于便携冰箱带回实验室。迅速采摘下叶片，刷净灰土，去除枯黄叶，剪切3～4 mm小段；按1g鲜重叶片∶4mL水的比例用无菌蒸馏水在18～20℃室温下震荡浸泡48h后，用灭菌纱布和双层滤纸进行过滤，再用0.45μm微孔滤膜过滤得到0.25g／mL浓度的浸提母液。将母液分别用无菌蒸馏水稀释 为 0.025，0.05，0.075，0.10，0.15，0.20g／mL不同浓度后，存于4℃冰箱。每个培养皿（Φ9 cm）铺2层滤纸，分别加入5mL各浓度浸提液，无菌蒸馏水为对照。

1.3.2 种子萌发及生物检测方法

选取大小均匀的红三叶种子，用10%的H2O2消毒5min，再用无菌蒸馏水冲净，均匀排列于备好的培养皿内，每皿50粒，上盖封好。前3d置于恒温培养箱发芽（25℃黑暗，70%RH）；从第4天开始，改为20℃黑暗12h，25℃光照12h。每天开盖透气10min，并记录发芽数（胚根突破种皮2mm时为发芽）；每隔3d固定补充适量红三叶水浸提液或无菌蒸馏水1次，每个处理3次重复。第7天分别随机从各培养皿中抽取10～15株幼苗测定其胚根长、下胚轴长。

1.4 数据统计

用SPSS 20.0进行方差分析（One－way ANOVA）和Duncan描述法分析数据。

发芽势（%）＝3d正常发芽的种子数／供试种子总数×100%；

发芽率（%）＝发芽种子数／供试种子总数×100%；

化感指数 RI＝1－C／T（当T≥C 时）；RI＝T／C－1（当T＜C时），其中：C 指对照值，T 指处理值，RI＞0表示促进作用，RI＜0表示抑制作用，RI绝对值的大小与化感作用强度一致。

2 结果与分析

2.1 不同浓度叶浸提液对红三叶种子发芽势的影响

不同浓度叶浸提液对红三叶种子发芽势的化感作用表现不尽一致，既有促进作用又有抑制作用（表2）。其中，低浓度0.025g／mL叶浸提液对种子发芽势起促进作用，化感指数为0.02，且与最高浓度0.20g／mL处理的种子发芽势差异极显著（p＜0.01），与0.05，0.15 g／mL处理下的种子发芽势差异显著（p＜0.05）；最高浓度0.20g／mL对种子发芽势的抑制作用最大，化感指数为－0.31，与对照差异极显著（p＜0.01）；0.075～0.20g／mL范围内，叶浸提液对种子发芽势的抑制作用随着浓度增大而增大。

表2 不同浓度叶浸提液对红三叶种子发芽势的影响

2.2 不同浓度叶浸提液对红三叶种子发芽率的影响

不同浓度叶浸提液对红三叶种子发芽率均表现出抑制作用（表3）。其中：浓度0.050g／mL 和0.20 g／mL叶浸提液对种子发芽率抑制作用较大，化感指数在－0.13；0.050～0.10g／mL范围内，叶浸提液对种子发芽率抑制作用随浓度增大而减小，而在0.10～0.20 g／mL范围内，叶浸提液对种子发芽率抑制作用随着浓度增大而增大。

2.3 不同浓度叶浸提液对红三叶种子胚根长的影响

不同浓度叶浸提液对红三叶种子胚根的生长发育均为抑制作用（表4）。其中：最高浓度0.20g／mL对幼根的抑制作用最大，化感指数为－0.75，与对照差异极显著（p＜0.01），且与最低浓度0.025g／mL处理下的胚根长差异极显著（p＜0.01）；0.050～0.20g／mL处理下的胚根长与对照、最低浓度0.025g／mL差异极显著（p＜0.01）；浓度达到一定临界值时，抑制作用会变小或变大。

表3 不同浓度叶浸提液对红三叶种子发芽率的影响

表4 不同浓度叶浸提液对红三叶种子胚根长的影响

2.4 不同浓度叶浸提液对红三叶下胚轴长的影响

表5 不同浓度叶浸提液对红三叶下胚轴长的影响

不同浓度叶浸提液对红三叶下胚轴长的影响不尽相同（表5）。其中：仅有0.050g／mL和0.20g／mL处理的下胚轴长受到抑制，其余处理均表现为促进作用；0.050g／mL的抑制作用较大，化感指数为－0.03，与0.025，0.15g／mL处理下的下胚轴长差异显著（p＜0.05）；最低浓度0.025g／mL的促进作用最大，化感指数为0.19，与对照差异显著（p＜0.05），且与0.050，0.20 g／mL差异显著（p＜0.05）；0.075～0.15g／mL区间内，叶浸提液对下胚轴长产生了促进作用，且随着浓度的增加促进作用增大，浓度达到0.15g／mL时，化感指数为0.15。

3 讨论与结论

有研究表明，红三叶对许多植物具有强烈的化感作用，从而形成稳固的种群，维护自身的繁衍和生息，与本研究结果一致［11，19－21］。本试验结果表明，红三叶不但对其他植物具有化感作用，而且对自身种子发育也有化感作用。发芽势和发芽率是植物种子发育的重要指标，常用来评价种子的发芽速度和整齐度［22－23］；从发芽势和发芽率这2个指标来看，不同浓度叶浸提液对红三叶种子发芽势既有促进作用又有抑制作用，大致表现为“低促高抑”的影响。而叶浸提液对种子发芽率具有抑制作用，且在一定的浓度区间内具有浓度效应。植物的胚根发育的好坏，直接关系着种子萌发的营养摄入状况。从胚根生长发育指标来看，不同浓度叶浸提液对红三叶种子胚根的生长发育均具有极强的抑制作用，本试验选取的最高浓度为0.20g／mL，与对照差异极显著（p＜0.01）。依此推断，随着浓度的加大，抑制作用会更强。试验中还发现，在不同浓度处理后，红三叶种子的根部出现上卷的现象（图1），这很容易进一步导致败育，由此可知，导致红三叶生物量下降的原因之一是化感物质通过对根部的抑制影响其对营养成分的吸收，进而影响地上营养体的生长。可见根部对化感物质的反应比较敏感，所以今后在实际生产中一定要注意化感物质对根部的调节作用，减少根部与化感物质的接触。种子发育可以依靠下胚轴来顶破土壤进行生长。可见下胚轴的健康生长与否，对植物生长意义非常重大。本试验0.075～0.15g／mL处理过的种子下胚轴长随着浓度增加而不断增大，当浓度达到0.20g／mL时，这种促进作用转化为了抑制作用，说明叶浸提液在一定浓度范围内对下胚轴长产生了“低促高抑”作用。

红三叶在栽培生产中，其残茬叶片在土壤中经过多长时间可以分泌出化感物质，这些物质在经过淋溶和分解后进入土壤，又要经过一个怎样的反应过程，是否会对化感强度产生影响，还有待进一步的研究。本试验只是在室内通过种子发芽试验检测了红三叶对自身种子的化感作用，而大田土壤环境因素十分复杂［24－26］，因此，今后有必要结合实际，在大田或者花盆中进行砂培实验，以对红三叶的化感作用做进一步深入的研究。

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