秦登科， 刘天一， 刘方军



骨形态发生蛋白2/7异源二聚体治疗骨缺损的研究进展

秦登科， 刘天一， 刘方军

骨形态发生蛋白； 异源二聚体； 同源二聚体； 成骨分化

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)除了BMP-1外，均属于转化生长因子β超家族的成员，可以诱导骨和软骨分化、促进新骨形成，在骨、软骨的缺损修复中发挥着重要的作用[1-3]。BMPs已知有十几种，其中生物活性较高、成骨作用较强的为BMP 2、4、5、6、7、9蛋白[4]，其中BMP 2、7已获美国FDA认证应用于临床特殊的病例，如脊柱融合术、长骨骨干缺损修复等[5]。然而，BMP蛋白的临床应用伴随发生肿胀、积液及肿瘤发病率提高等不良反应，这明显与BMP蛋白的超高剂量的应用有着密不可分的关系[3,6]。BMP通常以同源二聚体的形式存在，但研究发现，BMP 2/7异源二聚体的诱导成骨活性比其同源二聚体高4～6倍，诱导活性的提高可以减少BMP蛋白的使用剂量，进而减少炎症、软组织水肿以及异位再生骨等不良反应的发生，同时也降低患者的经济负担，因此是骨缺损修复的理想选择[7]。笔者对BMP 2/7异源二聚体的基因结构、其诱骨活性增强的可能机制等方面进行探讨。

1 BMP 2/7异源二聚体的基因结构

活性BMP分子多数为同源二聚体，即由二硫键连接2条氨基酸排列顺序相同的肽链组成,而由2条氨基酸排列顺序不同的肽链组成的为BMP异源二聚体。同时，BMP分子N-和O-末端的糖基化提高了其稳定性并延长了半衰期。除了位于C-蛋白末端结构域的成熟蛋白序列，BMP分子的400～500个氨基酸前体共用一个在N-末端的信号肽，包含从100～140个氨基酸残基，有7个保守的半胱氨酸残基，其中6个形成分子内二硫键(胱氨酸)，最后1个残基构成分子间二硫化物桥梁，借以形成同源二聚体蛋白分子[8-9]。Dang等[10]通过设计BMP7及2的特异性引物，即携带有限制性内切酶Nde Ⅰ序列的 5′-BMP7上游引物(5′-GGAATTCCATATGTCCACGGGGAGCAA ACAGCG-3′)和含接头蛋白(Gly4Ser)3编码序列的3′-BMP7下游引物(5′-CAGGCCCGGACACCGACGGTGCCTCCTCCTCCTAGCCCTCCTCCTCCTAGCCCTCCTCCTCCTAGC-3′)及携带有同样连接蛋白编码序列的5′-BMP 2上游引物(5′-GGAGGAGGAGGATCGGGAGGAGGAGGATCGGGAGGAGGAGGATCG

CAAGCCAAACACAAACAG-3′)和含有限制性内切酶EcoR Ⅰ编码序列的3′-BMP 2下游引物 (5′-CTCCCAACACCCACAGCGATTCTTAAGG-3′)，将其用于重叠延伸基因扩增技术SOE-PCR，获取了BMP7和BMP 2的杂交基因片段，继而通过基因重组技术实现了由接头蛋白(Gly4Ser)3串联的BMP 2-7融合蛋白的表达。

2 BMP 2/7异源二聚体诱导成骨的研究

2.1 体外实验

一些体外实验研究证实了BMP异源二聚体具有更强的诱骨活性，然而，针对不同的靶细胞，其诱骨活性也是有差别的。早在1995年，A Aono等通过杆状病毒表达系统获得BMP 4/7异源二聚体，利用胶原蛋白作为载体将其导入小鼠的骨髓基质细胞中，它所表现出的诱骨活性是BMP 4和BMP7同源二聚体的3倍以上。而Zhao等培养多品种的细胞系如 C3H10T1/2、ST2、C2C12等，通过检测ALP活性发现，BMP 2/7、BMP 4/7组表现出的活性远远高于对照组的同源二聚体[11]。Zheng等[12]建立破骨细胞系的模型，同时通过控制调节BMP 2/7异源二聚体的浓度，发现在低剂量(5～50 ng/ml)时更能有效的提高破骨细胞的功能，这可能有助于更快速和更早期的诱导和重塑新骨。Myllylä等[13]将BMP 4和BMP 2/7导入小鼠皮肤来源的成纤维细胞和真皮乳突细胞，均表现出了成骨现象，说明实验时不仅可以选择干细胞，还可以寻找一些其他的细胞替代。通过培养蟾蜍的干细胞系，Neugebauer等[14]发现BMP 4在稳定BMP 4/7异源二聚体配体和提高其成骨活性方面均有重要的作用。Carpenter等[15]采用人源及马源性BMSC作为靶细胞，却未发现有明显的诱骨活性；同样，Zhang等[16]利用人脂肪来源干细胞作为靶细胞时，BMP 2/7异源二聚体却并未表现出优于同源二聚体的诱骨活性，这可能是由于BMP 2/7异源二聚体对人源性干细胞的不敏感所致，据此推测，BMP异源二聚体的诱骨活性可能存在着种属特异性，这需要在以后的实验中进一步研究证实。

2.2 体内实验

Zhu等[17]构建了大鼠的脊柱融合实验模型，利用腺病毒介导BMP 2、7基因共转染的方法来获得BMP 2/7异源二聚体蛋白，并与其同源二聚体相比较，发现BMP 2/7异源二聚体明显提高了大鼠的脊柱融合率，增加了骨体积，同时也提高了骨形成率。Zhao等[11]通过腺病毒载体将BMP 2、7靶基因共转移至靶细胞，并移植到C57BL6小鼠皮下，结果发现基因修饰组的小鼠骨缺损处产生了更多的骨组织并且新生骨皮质内可见成熟骨小梁及骨髓结构，而且Ad-BMP 2/7组新生骨组织的骨量和缺损修复的骨痂总面积都远远大于非Ad-BMP 2/7组；同时，该研究小组在修复小鼠颅骨缺损实验中也发现，BMP 2/7异源二聚体在缺损部位诱导形成的新生骨骨量是对照组骨量的2倍，然而，骨缺损边缘部位亦出现了骨增生过多的现象，推测这与局部BMP 2/7异源二聚体的过分泌表达有关[18]。Wang等的实验研究却发现只有低剂量BMP 2/7异源二聚体的局部应用才更有利于缺损部位的诱骨效果[19]。Sun等[20]发现，BMP 2/7异源二聚体能在大型哺乳动物猪的颅骨缺损区诱导产生更多的新生骨组织，定量分析结果显示新生骨的总面积及其成骨分化指标，如COLI、ALP、OCN等靶基因的表达量明显优于对照组。

2.3 BMP 2/7异源二聚体诱导成骨的生物学作用机制2.3.1 BMP 2/7异源二聚体受体的研究 BMP蛋白特异性受体通常以二聚体的形式在细胞表面形成跨膜受体复合物，该复合物主要由两类受体组成，即BMPⅠ型和BMPⅡ型受体[21]。BMPⅠ型受体主要包括3种受体，即ALK2(ActR-IA)、ALK3(BMPRIA)和ALK6(BMPRIB)；而BMPⅡ型受体则包括ActR-Ⅱa、ActR-Ⅱb、AMHR-Ⅱ和 BMPR-Ⅱ型受体[22]。不同类型的BMP同源二聚体蛋白与不同类型受体的亲和力也是不一样的。Isaacs等利用表面等离子体共振技术发现，BMP 2/6异源二聚体蛋白与BMPⅠ型和BMPⅡ型受体的亲和力均强于BMP 2和BMP 6同源二聚体，而且其激活Smad信号传导通路的能力亦远大于相应的BMP同源二聚体蛋白[23]。Buijs等[24]的研究结果亦证明BMP 2/7异源二聚体对BMP受体的亲和力明显高于其相应的同源二聚体蛋白，推测BMP 2/7异源二聚体蛋白所表现出的高效诱骨活性可能与其和BMP受体的亲和力增加有关[25]。根据BMP作用靶细胞系的不同，BMP受体不仅可以激活传统的Smad信号传导通路， 亦可激活ERK、(MAPK)p38，JNK等非Smad信号传导通路，从而参与其诱导成骨的生物调控作用[22,26-28]。Koh等[18]利用Ad-BMP 2、7基因共转染技术成功制备重组BMP 2/7异源二聚体蛋白并作用于体外培养的小鼠成肌细胞株C2C12，结果发现BMP 2/7异源二聚体更易于促进信号传导因子Smad1/5/8的磷酸化,从而表现出更强的成骨诱导分化能力。然而是否存在其他因素激活Smad信号通路及是否存在其他未知可诱导骨生成的信号通路，需要在以后的实验中加以研究[27]。

2.3.2 细胞信号传导抑制因子 研究表明，细胞中存在信号传导抑制因子，如负显性受体BAMBI、竞争性受体抑制剂Noggin等参与BMPs信号传导通路的调节，以防止其过度激活[28-29]。BMP 2/7异源二聚体的诱骨活性增强可能与其信号传导通路中的信号抑制因子的反馈调控活性有关。Zhu等[29]研究发现，与BMP 2及BMP7的同源二聚体蛋白相比，BMP 2/7异源二聚体通过刺激靶细胞C2C12成肌细胞，能够明显下调竞争性受体抑制剂Noggin的表达，且添加外源性Noggin细胞因子也并未对BMP 2/7异源二聚体的诱骨能力产生明显的影响，这可能与BMP 2/7异源二聚体对受体抑制剂Noggin的不敏感性有关。

3 展望

通过基因转移技术获取BMP生长因子基因修饰靶细胞，进而与可降解生物支架材料复合构建组织工程骨并移植入骨缺损部位，是治疗临床大面积临界骨组织缺损的一个新途径。BMP 2/7异源二聚体蛋白因具有强效诱骨活性及使用剂量低等优点，具有良好的临床应用前景，但是，由于目前仍存在一些问题而限制了其在组织工程中的广泛应用。在BMP因子导入的缺损部位常出现一些不良组织反应，如骨吸收、异骨增殖、局部炎症反应等；BMP因子应用的最适剂量浓度仍不清楚；过高剂量的应用带来的极大不良反应；同时如何选取合适的组织工程支架材料作为载体，以模拟BMP生长因子在体内的生理性释放过程，都将是我们以后需要关注并研究的方向。

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国家自然科学基金(81372091)

200040 上海,复旦大学附属华东医院 整形外科(秦登科，刘天一)；潍坊医学院整形外科医院(刘方军)

秦登科(1992-)，男，河南商丘人，硕士研究生.

刘天一，200040，复旦大学附属华东医院 整形外科，电子信箱：tianyiliucn@126.com；刘方军，261041，潍坊医学院整形外科医院，电子信箱：liufjmd@gmail.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.10.018

2016-06-23)