紫丹银屑颗粒对银屑病模型小鼠的HaCaT细胞周期和血清IL-2、TNF-α的影响

李伟妮1，李忠原1,崔文2，王平3，孙虎3，李百开1

(1.烟台东诚大洋制药有限公司，山东 烟台 265500；2.青岛大学附属医院，山东 青岛 266003；

3.山东省中医药研究院，山东 济南 250014)

摘要：目的探讨紫丹银屑颗粒对银屑病样小鼠模型的治疗作用和作用机制，为临床应用提供参考。方法将试验动物随机分为正常对照组、模型对照组、紫丹银屑高、中、低剂量组及阳性对照组，每组10只，灌胃给药。采用流式细胞分析仪分析紫丹银屑颗粒对HaCaT细胞周期的影响(在96孔板上依次设定紫丹银屑颗粒2、4、8、16、32 g·L-1组，维A酸片8 g·L-1组，空白细胞组)；采用动物体内实验，观察紫丹银屑颗粒对银屑病小鼠模型血清中白介素-2、肿瘤坏死因子含量的影响。结果体外试验显示，与模型组比较，紫丹银屑颗粒高、中剂量组细胞增殖数量显著减少，有显著性差异(P<0.05)；体内试验显示，与模型组比较，紫丹银屑颗粒高、中剂量组S期细胞数量显著减少，有显著性差异(P<0.05)。结论紫丹银屑颗粒能够显著抑制人永生化表皮细胞增殖，并显著降低模型动物血清白介素-2、肿瘤坏死因子的含量，这可能是紫丹银屑颗粒治疗银屑病的作用机制之一。

关键词：紫丹银屑颗粒；HaCaT细胞；白介素-2；肿瘤坏死因子；小鼠

作者简介：李伟妮，女，研究方向：中药学，E-mail:liweini@163.com

通讯作者：王平，女，副研究员，研究方向：中药药理，Tel:0531-82949812,E-mail:wangpingjinan@163.com

中图分类号：R965文献标识码：A

Effect on the HaCaT cell generation cycle and serum IL-2，TNF-α of

psoriasis sample model mice treating by Zidanyinxie Particle

LIWei-ni1，LIZhong-yuan1,CUIWen2，WANGPing3,SUNHu3，LIBai-kai1

(1.YantaiDongchengDayangPharmaceuticalCo.,Ltd.,Yantai265500，China；2.TheAffiliated

HospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266003，China；3.DepartmentofPharmacology,

ShandongAcademyofChineseMedicine，Jinan250014，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of Zidanyinxie Particle for mice psoriasis sample.MethodsAll the mice were randomly divided into normal control group,model group,Zidanyinxie Particle high dosage group,Zidanyinxie Particle middle dosage group，Zidanyinxie Particle small dosage group,and positive control group,each group had 10 mice，gavaged.Prepared serum containing drug,concentration was Zidanyinxei Particle 2,4,8,16,32 g·L-1,Tretinoin Tablets 8 g·L-1.In vitro test，to detect the effect of Zidanyinxie Particle in HaCaT cell generation cycle;In vivo test,after giving relevant drugs，to observe serum IL-2 and TNF-α of vaginal epithelial pathological model mice.ResultsIn vitro experiments,compared with model control group，cell proliferation was significantly reduce in the Zidanyinxie Particle high dosage group,Zidanyinxie Particle middle dosage group,P<0.05.In vivo studies,compared with normal control group，the number of mitotic vaginal epithelial cells were significantly increased in model group,P<0.05,and compared with model control group，the number of mitotic vaginal epithelial cells were significantly decreased in Zidanyinxie Particle high dosage group,Zidanyinxie Particle middle dosage group,P<0.05.ConclusionZidanyinxie Particle could inhibited the proliferation of HaCaT cell and reduced the Serum IL-2,TNF-α content of mice model significantly，this may be one of the mechanisms of Zidanyinxie Particle in treating psoriasis.

Key words:Zidanyinxie Particle;HaCaT cell;IL-2;TNF-α;Mice

银屑病是一种皮肤科常见的易反复发作的疾病，被世界卫生组织定为十大顽疾之一。临床表现为周身或者局部皮肤白色鳞屑，病理学表现为表皮细胞过度增殖及异常分化，炎症细胞浸润，真皮血管增生[1，2]。银屑病根治困难，容易复发，病程迁延日久，肌肤失养，摧残身体，给患者带来极大的心理和生理负担，临床迫切需要开发相应的治疗药物。紫丹银屑颗粒，是根据临床经验方开发的新药，用于治疗血虚风燥所致的银屑病。通过体外细胞试验和体内动物试验对其作用机理进行了探讨，分析紫丹银屑颗粒对人永生化表皮细胞(HaCaT细胞)周期的影响，观察紫丹银屑颗粒对银屑病小鼠模型血清中白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF-α)含量的影响。

1试验材料

1.1试验动物ICR小鼠，SPF级，110只，雌性，体重18～22 g，购自中国医学科学院动物研究所，动物许可证号：SCXK(京)2009-0007。

1.2试验药物紫丹银屑颗粒(生产批号：110602，烟台东诚大洋制药公司)；维A酸片(生产批号：H10970054，山东良福制药有限公司)；秋水仙碱(生产批号：111103，西双版纳药业有限责任公司)；己烯雌酚(生产批号：100318，天津金耀氨基酸有限公司)。

1.3试验试剂HaCaT细胞(北京协和医学院细胞资源中心)；IL-2试剂盒(上海邦奕生物科技有限公司)； TNF-α试剂盒(上海富众生物科技发展有限公司)；胎牛血清(美国GLBCO公司)；细胞周期及凋亡检测试剂盒(RNase+PI，南京凯基生物科技公司)；RPM1640培养基(美国GLBCO公司)。

1.4试验仪器超净工作台(苏州净化设备仪器厂)；HF151UVCO2培养箱(上海力新实业有限公司)； BIO-RAD680酶标仪(美国BIO-RAO公司)；TDL-5台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；DNP-9052型电热恒温培养箱(上海惊宏实验设备有限公司)；FAC scalibur流式细胞分析仪及软件(美国B&D公司)。

2试验方法

2.1体外试验

2.1.1HaCaT细胞培养HaCaT细胞用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下传代培养，选对数生长期细胞进行试验。

2.1.2紫丹银屑颗粒含药血清的制备取50只雌性小鼠，随机分为5组，每组10只，分别为正常对照组、紫丹银屑颗粒低、中、高剂量组、维A酸片组。参考《药理实验方法学》[3]中人与小鼠之间的剂量换算方式，折算小鼠的给药量，分别设置紫丹银屑颗粒高剂量组(2.16 g·kg-1)、紫丹银屑颗粒中剂量组(1.08 g·kg-1)、紫丹银屑颗粒低剂量组(0.54 g·kg-1)，维A酸片组(2.70 g·kg-1)，正常对照组给予等体积的蒸馏水。连续灌胃给药5 d，每日1次。末次给药0.5 h后，摘眼球取血，弃去第1滴血液。血液静置1 h，3 000 rpm，离心5～10 min，取血清，56 ℃、30 min灭活，0.22 μm微孔滤膜除菌分装，稀释成10%浓度的含药血清。

2.1.3紫丹银屑颗粒对HaCaT细胞周期的影响将对数生长期的HaCaT细胞按照每毫升2×105的浓度接种于96孔板上，依次设定为紫丹银屑颗粒2、4、8、16、32 g·L-1组，空白细胞组，维A酸片8 g·L-1组，每组3个复孔。药物干预48 h后，消化贴壁生长的HaCaT细胞收集于EP管中，用预冷的PBS吹匀，再以2 000 rpm，离心15 min，弃去上清液，加入4 ℃预冷75%乙醇3 mL，固定30 min后再次离心，重悬，用流式细胞仪测定细胞周期。试验结果进行组间统计分析。

2.2体内试验

2.2.1建立银屑病动物模型将60只雌性小鼠，随机分为6组，分别为正常对照组、模型对照组、紫丹银屑颗粒高剂量组(2.16 g·kg-1)、紫丹银屑颗粒中剂量组(1.08 g·kg-1)、紫丹银屑颗粒低剂量组(0.54 g·kg-1)，维A酸片组(2.70 g·kg-1)，每组10只。除正常对照组以外小鼠均腹腔注射己烯雌酚，每次0.2 mg，每天1次，连续3 d。

2.2.2紫丹银屑颗粒对银屑病动物模型血清IL-2、TNF-α的影响从造模第4天开始，各给药组分别给予相对应的药液，正常对照组与模型对照组给予等体积的蒸馏水，连续给药5 d。于试验第9天灌胃后2 h后各组小鼠腹腔注射秋水仙碱2 mg·kg-1，使有丝分裂停止于中期。4 h后各组小鼠摘眼球取血，离心后，取血清，分别检测血清IL-2、TNF-α的数值，试验结果进行组间统计分析。

3试验结果

3.1体外试验中各组HaCaT细胞周期比较 试验结果发现细胞的各个周期发生了改变。与模型组比较，紫丹银屑颗粒高、中剂量组S期细胞数量显著减少，有显著性差异(P<0.05)；与维A酸组的细胞数量接近，P>0.05，结果见表1。

表1　各组小鼠HaCaT细胞周期比较

注：与正常对照组比较，＊P<0.05；与模型组比较，▲P<0.05

3.2各组血清中IL-2、TNF-α含量结果试验结果显示，与模型对照组相比，紫丹银屑颗粒高、中、低剂量组均能够显著降低造模大鼠血液中IL-2、TNF-α的含量，其中高剂量试验结果有非常显著性差异(P<0.01)，中剂量试验结果有显著性差异(P<0.05)，结果见表2。

表2　紫丹银屑颗粒对小鼠血清IL-2、TNF-α的含量

注：与正常对照组比较，＊P<0.05；与模型对照组比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01

4讨论

银屑病是一种由于多种因素参与的慢性免疫性皮肤病，其致病机理复杂，发病率高。主要的病理改变为角质增厚，角化不全，表现为皮肤银白色鳞屑，属于中医“白疕”范畴[4，5]。中医学认为银屑病的病因病机为血热内蕴、阴血耗伤，生风致燥，肌肤失养，则起白屑。即本病病因在血，病位在肌表。在长期的治疗过程中，发现银屑病患者大都畏寒喜热，同时伴有口干舌燥，心烦易怒等，故认为银屑病久病出现阳虚寒凝，阴血耗伤，气滞血瘀，使皮肤失于濡养而发病[6，7]。 紫丹银屑颗粒，由紫硇砂、决明子、附子(制)、干姜、桂枝、白术、白芍、黄芪、丹参、降香等10味中药组成，具有温养活血、养血祛风、润燥止痒的功效[8]，临床治疗银屑病疗效确切。体外试验结果显示，紫丹银屑颗粒具有显著抑制HaCaT细胞过度增殖， 促使细胞的自然生长平衡，最终维持表皮层的稳定。同时，紫丹银屑颗粒能够降低小鼠血清IL-2、TNF-α含量的含量，从而减轻银屑病发病后的炎症反应。本研究为临床合理用药提供了参考。

参考文献：

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[2]韩玲.银屑病药效学动物模型及其在中药新药研究中应用的思考[J].中药药理与临床，2006，22(6)：73-75.

[3]徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，1982.

[4]鹿见香,李锘,朴珉贞,等.祛银颗粒对角质形成细胞生长因子诱导的HaCaT细胞增殖及分泌TNF-α的影响[J].中国中医急症，2014，23(6)：1025-1028.

[5]康尔恂，李新宇，郑家润.角质形成细胞生长因子对HaCaT细胞增殖的影响[J].中国麻风皮肤病杂志，2006，22(2)：108-110.

[6]封绍奎，雷鹏程，万俊增.皮肤性病学[M].北京：中国协和医科大学出版社,2000.

[7]常立新，刘小雷,张铭杰,等.百应胶囊治疗银屑病的实验性药效学研究[J].中国药物与临床，2009,9(4):327.

[8]陶萍,聂洪邵,徐晴娇,等.紫丹银屑颗粒治疗银屑病的临床观察[J].齐鲁药事，2010,29(6)：372-373.