帕立骨化醇联合氯沙坦治疗糖尿病肾病大鼠的实验研究*

兰凯张光伟常远武晓慧张渭民宫博文

(西安医学院临床医学院， 陕西 西安 710021)

【摘要】目的观察维生素D类似物帕立骨化醇联合氯沙坦对糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)大鼠肾组织中肾素水平以及血浆中高敏C反应蛋白(high sensitivity-C response protein,hs-CRP)的影响。方法采用链尿佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射的方法构建DN大鼠动物模型，将造模成功的40只大鼠随机分为帕立骨化醇组(P组)、氯沙坦治疗组(T组)、帕立骨化醇+氯沙坦联合治疗组(L组)、DN组(D组)，每组10只；并设置健康对照组(N组)10只。给药12周后检测24小时尿蛋白定量、血浆hs-CRP及血生化指标，通过ELISA法检测肾组织中肾素和血管紧张素Ⅱ(angio- tensinⅡ，AngⅡ)浓度变化。结果与D组相比，P、T、L组24小时尿蛋白定量水平较低，L组24小时尿蛋白定量显著低于P组、T组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。与D组相比，P、T、L组、肾素及AngⅡ、hs-CRP水平降低，L组显著低于P组、T组，差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论帕立骨化醇联合氯沙坦治疗糖尿病肾病大鼠可更好地保护糖尿病肾病大鼠的肾功能，其机制可能与通过抑制肾素，降低hs-CRP水平有关。

【关键词】糖尿病肾病； 帕立骨化醇； 肾素； 高敏C反映蛋白

【中图分类号】R 587.2【文献标志码】A

基金项目：陕西省教育厅科技基金计划项目(14JK1625)

收稿日期：( 2015-01-15； 编辑： 张文秀)

Effects of paricalcitol and losartanin on treatment of diabetic nephropathy ratsLAN Kai, ZHANG Guangwei, CHANG Yuan,etal

(DepartmentofClinicalMedicine,Xi＇anMedicalUniversity,Xi＇an710021,China)

Abstract【】ObjectiveTo study the effects of 1,25- (OH)2 D3 analogs Paricalcitol and Lonsartan on the level of renin, high sensitivity-C response protein in the kidney of diabetic nephropathy (DN) rats and its possible mechanism. MethodsDN model rats were established by intraperitoneal injection with streptozotocin(STZ). All the DN rats were randomly divided into the paricalcitol group (group P), the losartan group (group T), the combination of paricalcitol and losartan group (group L), the DN group (group D) and the health control (group N). 24-h urinary protein and hs-CRP and serum biochemical indicators were examined after 12 weeks. ELISA methods were applied to detect the concentration change of renin and AngⅡ in the kidney. ResultsCompared with Group D, 24-h urinary protein of Group P, T and L were markedly decreased, Group L was significantly lower than Group P and Group T in 24-h urinary protein (P<0.05). Compared with Group D renin and AngⅡand hs-CRP of Group P, T and L were markedly decreased, Group L was significantly lower than Group P and Group T in renin and AngⅡand hs-CRP (P<0.05). ConclusionCombined therapy with Paricalcitol and Lonsartan could better improve the renal function of diabetic nephropathy rats,the decrease of rennin and CRP may be involved.

【Key words】Diabetic nephropathy； Proteinuria； Renin；High sensitivity-C response protein

糖尿病肾病是导致终末期肾病的主要原因之一，一旦发展到终末期肾病必须依靠肾脏替代治疗来维持，故早期治疗非常重要。微量蛋白尿是糖尿病肾病的早期标志，蛋白尿是影响肾功能的独立危险因素，在此时进行有效的干预治疗，可以起到早期肾保护作用。研究发现肾素、血浆hs-CRP水平与糖尿病肾病的严重程度及预后显著相关。活性维生素D具有独立于甲状旁腺激素调节作用[3]，可以减少糖尿病肾病大鼠的尿蛋白及肾损伤，但具体机制尚不清楚，可能与抑制肾素水平有关。本研究拟通过帕立骨化醇联合氯沙坦对糖尿病肾病大鼠肾组织中肾素水平以及血浆hs-CRP的影响，探讨其干预蛋白尿形成及肾保护的作用机制。

1材料与方法

1.1动物模型的建立与分组清洁2级封闭群雄性SD大鼠50只(浙江大学动物中心提供)，体质量(220±20)g。40只大鼠造模，10只为健康对照组(N组)。大鼠禁食10小时后，单次无菌腹腔注射65mg/kg体质量链脲菌素(STZ，美国Sigma)。72h后取尾静脉血测空腹血糖(FBG)，FBG≥16.65mmol/L确定为糖尿病大鼠，3周后尿蛋白量(24h)≥30mg确认DN大鼠模型制备成功；健康对照组注射等量的柠檬酸缓冲液。造模成功的DN大鼠随机分为：帕立骨化醇治疗组10只(P组)，予帕立骨化醇胶囊溶于丙二醇，以0．4μg/kg剂量每周灌胃3次；氯沙坦治疗组10只(T组)予氯沙坦片溶于蒸馏水，以10mg/kg的剂量每天灌胃；联合治疗组(L组)10只予帕立骨化醇0.4μg/kg每周灌胃3次 +氯沙坦10mg/kg每天灌胃；糖尿病肾病组10只(D组)。D组与N组给予等量丙二醇和蒸馏水灌胃，连续12周。12周后收集24小时尿及4~5ml动脉血。

1.2一般指标检测24小时尿蛋白定量，hs-CRP、血肌酐(Scr)、FBG、血钙、血磷和甲状旁腺激素(PTH)。

1.3肾素和AngⅡ测定将肾组织剪碎、加预冷的0.05mol/L PBS(10ml/g)，组织匀浆，离心(4000r/min×20min，4℃)，取上清液,-70℃冻存备用，用ELISA方法测定肾素和AngⅡ(美国Genzyme公司试剂盒)。

2结果

2.1各组大鼠一般指标变化实验期间糖尿病肾病造模大鼠出现明显多饮多尿以及消瘦,动作迟缓，皮毛萎黄无光泽；各组造模大鼠中，药物干预的3组大鼠一般情况好于D组。第12周时P组、T组、L组、D组24小时尿蛋白、肌酐和尿素氮水平均显著高于N组(均P<0.05)；与D组相比，P组、T组、L组24小时尿蛋白定量水平较低，L组24小时尿蛋白定量显著低于P组、T组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1　治疗12周后各组大鼠指标比较 ± s)

注：与D组相比，aP<0.05;与L组相比，bP<0.05

2.2各组大鼠肾组织肾素和AngⅡ改变P组、T组、L组、D组肾素、AngⅡ浓度高于N组(均P<0.05)；P组、T组肾素、AngⅡ浓度高于L组，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

Tab.2The concentration change of renin and AngⅡ in the renal tissue after 12w therapy

组别鼠数(只)肾素(μg/mg)AngⅡ(pg/mg)N组103.74±0.33ab18.44±2.26abP组105.77±0.38ab25.86±3.99abT组107.34±0.41ab24.86±3.26abL组105.53±0.34a23.72±4.01aD组1010.02±0.61b37.23±3.87b

注：与D组相比，aP<0.05;与L组相比，bP<0.05

2.3各组hs-CRP变化情况P组、T组、L组、D组hs-CRP高于N组(均P<0.05)；P组、T组hs-CRP浓度高于L组，差异有统计学意义(均P<0.05)，见表3。

3讨论

糖尿病肾病是糖尿病患者临床常见慢性微血管并发症之一，也是终末期肾病最常见病因之一。微量蛋白尿是糖尿病肾病的早期标志，也是糖尿病肾病进展的独立危险因素。目前蛋白尿发生的确切机制尚不清楚，有研究结果显示与肾小球滤过屏障密切相关，其蛋白结构的改变可能与糖尿病肾病时RAS系统激活有关[1-3]。肾脏系膜细胞AngⅡ合成增多，局部AngⅡ活性增高，可诱发肾小球内压增大，引起尿蛋白排泄增加。糖尿病肾病患者体内细胞炎性因子如IL-1、TNF-α、CRP、血小板活化因子等的合成增多，炎性因子具有促进肾小球动脉硬化及细胞增生的作用，且炎症反应的强度与糖尿病肾病肾脏损伤程度具有相关性[4-6]。CRP 是临床常用的炎性因子，对糖尿病肾病的严重程度及预后有重要的预测意义。本研究显示，糖尿病肾病组较正常对照组肾素、AngⅡ及CRP水平均有升高，提示这些指标与糖尿病患者肾脏损伤密切相关。

表3　治疗12周后各组大鼠血浆hs-CRP水平比较

注：与D组相比，aP<0.05;与L组相比，bP<0.05

活性维生素D即1，25-(OH)2D3是维生素D的活性形式，帕立骨化醇是维生素D类似物，具有与活性维生素D相似的生物学活性。它通过细胞内特异的维生素D受体(vitamin D receptor，VDR)介导发挥其生物学活性。近年来随着对活性维生素D研究的不断深入，发现其具有独立于钙磷代谢以外的肾脏保护作用[7，8]。DN时活性维生素D水平与血浆肾素活性和血管紧张素Ⅱ呈负相关[9，10]。通过转基因动物模型研究RAS和活性维生素D的相互关系发现，VDR基因敲除小鼠肾脏的肾素mRNA和蛋白水平表达均增加[11，12]。在给予野生型小鼠饮食添加锶，以抑制活性维生素D生物合成后，其肾脏肾素mRNA表达明显上调，而经注射维生素D活性物后，肾素表达下调，提示活性维生素D可抑制肾素的生物合成，是肾素表达的负性调节子[13]。活性维生素D可能通过调节抑制肾素合成基因表达的环腺苷酸(cAMP)信号通路，部分阻断cAMP与cAMP反应原件结合区对肾素基因启动子的活化，抑制肾素基因转录的启动，以减少肾素的合成[14]。

4结论

血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂(ARB)能降低糖尿病肾病患者的蛋白尿，但不是所有患者对这项治疗有反应。在许多病例中，由于RAS的不完全阻断，可引起代偿性激活肾脏球旁器分泌肾素，使血浆肾素活性出现代偿性升高， ARB阻滞RAS的作用减弱，出现血管紧张素Ⅱ和醛固酮逃逸现象[15]。而活性维生素D能通过抑制循环及肾脏局部组织RAS活性而对肾脏具有保护作用，其保护作用不依赖细胞外钙磷水平的变化，活性维生素D抑制肾素基因转录这一发现为使用维生素D类似物来补偿性抑制肾素增高提供了一个良好的理论基础。基于这个原理，我们的研究结果证明用ARB和维生素D类似物的联合治疗，可协同抑制RAS系统，抵消肾素的代偿性升高，降低炎性因子，起到更强的肾脏保护作用。

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