董俊+韩梅+邵华斌+罗青平+刘国平+张腾飞

摘要：为了解湖北省禽源空肠弯曲菌的流行病学及耐药性情况，从武汉市及其周边地区采取禽源样品276份，其中肛拭子175份，盲肠内容物101份。共分离出50株空肠弯曲菌，分离率为18.12%，其中肛拭子分离20株，盲肠内容物分离30株。结果显示，不同采样途径空肠弯曲菌的分离率不同，盲肠内容物分离率高于肛拭子。采用定性测定纸片扩散法对以上分离的菌株进行药敏试验，50株空肠弯曲菌分离株对氨基糖苷类药物敏感性最高（S≥66.0%），其次分别是红霉素（S=70.0%）和磺胺甲基异恶唑（S=58.0%）。对喹诺酮类药物耐药性最强（R=100%）。

关键词：弯曲菌;分离鉴定;耐药性

中图分类号：S852.61+3        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）23-5959-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.042

Isolation，Identification and Antimicrobial Susceptibility Proflles of Campylobacter jejuni Isolates from Poultry in Hubei

DONG Jun1，2，HAN Mei2，SHAO Hua-bin2，LUO Qing-ping2，LIU Guo-ping1，ZHANG Teng-fei2

（1.College of Animal Science， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei，China;

2.Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China）

Abstract： To investigate the epidemiological and antimicrobial susceptibility profiles of Campylobacter jejuni in poultry in Hubei province， 276 samples was collected， thereinto 175 were from feces and 101 were from contents of cecum. 50 （18.12%） Campylobacter jejuni was isolated in total， among the isolates， 20 isolates were separated from feces， and 30 isolates were separated from the contents of cecum. The results showed that the separation rate from contents of cecum was higher than that from feces. The disk diffusion test method was used to determine resistance of the isolates. The results showed that the isolates were most sensitive to aminoglycosides（S≥66%），secondly to erythromycin，sulfamethoxazole， and all strains were resistant to floroquinolones （R=100%）.

Key words：Campylobacter jejuni;Isolation and Identification;Drug resistance

弯曲菌（Campylobacter）是自然界中广泛存在的、全球范围内主要的食源性人兽共患性病原菌之一[1]。对人致病的弯曲菌中 93.4%为空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni，C. jejuni），2.3%为结肠弯曲菌（Campylobacter coli，C. coli），其他弯曲菌偶尔致病[2]。特定血清型空肠弯曲菌引起的肠炎是格林-巴利综合征（Guillain-Barre syndrome，GBS）的重要前驱因子[3-5]。

近年来，许多国家空肠弯曲菌发病率呈指数增长趋势，主要引起急性肠炎和食物中毒，并伴发反应性关节炎、肝炎、瑞特氏病和格林-巴利综合征等免疫性损伤性疾病。在兽医临床中，空肠弯曲菌可引起家畜流产、不孕、乳房炎及幼畜腹泻和家禽肝炎[6-9]。空肠弯曲菌是野生、家养动物的正常寄居菌，感染的动物通常无明显病症，但可长期向外界排菌，通过排泄物或分娩污染食物和饮水，从而引起人类感染。其中，家禽是空肠弯曲菌病最重要的传染源之一。随着畜牧养殖生产过程中抗生素药物的不合理使用，空肠弯曲菌的耐药性不断增强，尤其是对喹诺酮类和大环内酯类药物，也给空肠弯曲菌的防控带来了很大的困难。

了解空肠弯曲菌流行病学及其耐药性情况是预防和控制畜禽以及人类空肠弯曲菌病的重要前提，是保障公共卫生及养殖业健康发展的重要举措。本研究对湖北省采集的禽源样品进行空肠弯曲菌的分离鉴定，并进行了耐药性分析。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  样品来源  从湖北省不同养殖场及农贸市场采集肛拭子（拭子置于Cary-blair半固体运送培养基中，在采样后2 h内送实验室培养）及新鲜盲肠样品，共276份。endprint

1.1.2  培养基及试剂  炭头孢哌酮去氧胆酸（mCCDA）培养基、添加剂及厌氧罐购自OXOID公司，布氏肉汤、Cary-Blair半固体培养基购自北京陆桥生物科技公司，Taq酶、DNA Marker及基因组抽提试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司、微需氧产气袋购自日本MGC公司;常规试剂为国产分析纯试剂。

1.1.3  药物  药敏试纸片7大类16种均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

β内酰胺类：头孢噻肟、阿莫西林、氨苄西林、头孢哌酮、头孢曲松、头孢唑啉;氨基糖苷类：链霉素、新霉素、丁胺卡那;四环素类：四环素;磺胺类：磺胺甲基异恶唑;喹诺酮类：环丙沙星、诺氟沙星、环丙氟哌酸;林可酰胺类：林可霉素;大环内酯类：红霉素。

1.2  方法

1.2.1  细菌分离培养

用接种环挑取少量盲肠内容物接种到mCCDA选择性培养基上（肛拭子直接划线接种到mCCDA选择性培养基上）接菌后的平板置于厌氧罐中，根据厌氧罐容量2.5 L/袋的标准，放入微需氧产气袋（5%O2，10%CO2，85%N2），随后连同容器一并置于42 ℃培养箱中培养48 h。

1.2.2  空肠弯曲菌的分离纯化  在平板上挑取灰色、透明、针尖状或水珠状菌落划线于mCCDA平板上进行纯化。

1.2.3  菌株的保存  将分离得到的菌株，接种于含10%小牛血清的布氏肉汤中微需氧环境培养48 h，将菌液转入无菌EP管中，加入灭菌甘油使混合液中甘油浓度达到30%，-70 ℃保存。

1.2.4  细菌的初步鉴定  根据菌落生长特征、革兰氏染色特征、氧化酶试验和过氧化氢酶试验结果、按照GB/T4789.9-2014进行结果判定。

1.2.5  分子生物学鉴定

1）PCR鉴定引物的确定。参考Linton等[10]设计的空肠弯曲菌hipO基因引物：HIP400F： 5′-GAA GAG GGT TTG GGT GGT G-3′，HIP1134R： 5′-AGC TAG CTT CGC ATA ATA ACT TG-3′。

2）细菌总DNA的提取。将菌种接种于5 mL布氏肉汤（加新生牛血清10%），微需氧条件下培养48 h，离心收集菌体，用基因组抽提试剂盒提取菌株的总DNA，-70 ℃保存备用。

3）PCR扩增。PCR反应体系为25 μL， 包括2×Taq Plus Master Mix（Dye Plus）10 μL、DNA模板5 μL（10～100 ng）、上下游引物各1 μL，超纯水8 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35个循环;72 ℃延伸7 min。配制1%琼脂糖凝胶，取PCR产物5 μL加样，电压130 V，电泳24 min，凝胶成像系统拍照，分析试验结果。

1.2.6  药敏试验  根据临床用药情况和对公共卫生的影响，选择7大类16种抗菌药物，按照美国临床实验室标准化协会（CLSI 2010版）的标准，用定性测定纸片扩散法检测所有菌株对16种抗菌药物的耐药情况，参考CLSI标准和文献，符合表2所列标准则判定菌株耐药。

2  结果与分析

2.1  分离鉴定结果

276份样品分离出50株空肠弯曲菌，分离率18.12%。其中肛拭子分离20株，盲肠内容物分离30株，分离率分别为11.43%和29.70%（表1）。结果显示，不同采样途径空肠弯曲菌的分离率不同，盲肠内容物分离率明显高于肛拭子。

2.2  细菌初步鉴定

分离菌在mCCDA平板上表面长出透明有光泽，较小的圆形光滑，灰色闪金属光的菌落，该菌落扁平湿润，呈扩散性生长;用接种环挑有黏性的菌落，染色镜检为革兰阴性，菌体弯曲如小逗点状，呈S形、螺旋状或海鸥展翅状。

对50株分离菌株进行了生化试验，结果均符合空肠弯曲杆菌的生化特征，氧化酶试验、过氧化氢酶试验、马尿酸盐水解试验、吲哚乙酸脂水解试验均为阳性。

2.3  PCR鉴定结果

电泳结果显示，该PCR方法对空肠弯曲杆菌能扩增出特异性片段，大小为735 bp。

2.4  药敏试验结果

50株空肠弯曲菌对氨基糖苷类药物敏感性最高（S≥66.0%）;其次分别是红霉素（S=70.0%）和磺胺甲基异恶唑（S=58.0%）;对喹诺酮类药物耐药性最强（R=100%）。

3  讨论

家禽肉制品是日常饮食生活中常见的食物，随着人民生活水品的提高，家禽肉制品的消费量越来越大。近年来，国内外空肠弯曲菌感染人的趋势率逐年上升，家禽是人感染弯曲菌的主要来源，据报道，鸭泄殖腔中分离的弯曲菌分离率高达96.6%。在日本鸡源弯曲菌分离率高达47.2%，禽源空肠弯曲菌对人类卫生安全造成了潜在的威胁[11]。

此次调查湖北地区禽源空肠弯曲菌的流行性情况，在采集样品的8个地区家禽群中呈现阳性，分离率为18.12%，说明空肠弯曲菌已在湖北地区家禽中普遍存在。另外，不同采样来源的分离率不同，盲肠内容物分离率高于肛拭子。空肠弯曲菌对周围环境敏感且易进入活的但不可培养（VBNC）状态，空肠弯曲菌的最适合定植在动物肠道37～42 ℃的微需氧环境，利用肠道的有利环境进行生长繁殖。而泄殖腔靠近外界环境，营养、温度和微需氧条件都达不到最适条件，因此分析泄殖腔内的空肠弯曲菌活性程度自然较低，分离率也就较肠黏膜分离率低。endprint

空肠弯曲菌的耐药性日趋严重的问题已经引起了世界各国的重视，但目前还没有广泛认可的空肠弯曲菌耐药标准，阻碍了空肠弯曲菌耐药性的研究[12]。本研究为食源空肠弯曲菌的耐药性研究提供了一定的基础数据。结果显示，空肠弯曲菌分离菌株对氨基糖苷类药物敏感性最高，其次分别为红霉素，磺胺甲基异恶唑，对喹诺酮类药物耐药性最强。人类可通过食用受到耐药菌株污染的食物而感染发病，并且会产生耐药性，所以应该引起高度的重视。空肠弯曲菌对氨基糖苷类药物敏感性高，对喹诺酮类药物耐药性强，这与国外报道的相一致[13，14]。据Alfredson等报道，空肠弯曲菌对喹诺酮类药物耐药性增强，可能因为抗生素药物的频繁使用导致C257T gyrA基因的单一突变[15]。这可能与畜禽养殖中使用的饲料添加剂及临床使用药物的频率、强度有关。从公共卫生健康的角度来看，喹诺酮类药物在食用动物中使用的监测应该迅速建立起来。

参考文献：

[1] BLASER M J.Epidemiologic and clinical features of Campylobacter jejuni infections[J]. Journal of Infectious Diseases， 1997，176： 103-105.

[2] Eurosurveillance Editorial Team.The European Union summary report on trends and sources of zoonoses， zoonotic agents and foodborne outbreaks in 2010[J].Euro Surveill，2012，17：20113.

[3] BLASER M J， ENGBERG J. Clinical aspects of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli infections[M].England： ASM Press，2008.

[4] O′HARA J R，FEENER T D，FISCHER C D，et al. Campylobacter jejuni disrupts protective Toll-like receptor 9 signaling in colonic epithelial cells and increases the severity of dextran sulfate sodium-induced colitis in mice[J].Infection and Immunity，2012， 80： 1563-1571.

[5] GRADEL K O，NIELSEN H L，SCH？覫NHEYDER H C，et al. Increased short and long-term risk of inflammatory bowel disease after Salmonella or Campylobacter gastroenteritis[J].  Gastroenterology， 2009，137： 495-501.

[6] ANG C W，VAN DOORN P A，ENDTZ H P， et al. A case of guillain-barre syndrome following a family outbreak of Campylobacter jejuni enterities[J].J Neuroimmunol，2000，11（2）： 2229-2233.

[7] 吴  润，赵晋军.空肠弯曲杆菌研究现状分析[J].中国兽医科技，1995，25（7）：16-18.

[8] KLEIN B S，VERGERONT J M，BLAZER MJ，et al. Campylobacter infection associated with raw milk[J].AMA，1986，17 （225）： 3361-3364.

[9] LINTON D，OWEN RJ，STANLEY J.Rapid identification by PCR of the genus Campylobacter and of five Campylobacter species enteropathogenic for man and animals[J].Ges Microbiol，1996，147（3）：707-718.

[10] LINTON D，LAWSON A J，OWEN R J，et al. PCR detection，identification to specie slevel，and finger printing of Campylobacter coli from diarrheicc samples[J].Journal of Clinical Microbiology，1997，35：2568-2572.

[11] BAI W，SE-YEOUN CHA，MIN K，et al. Antimicrobial Susceptibility Profiles and Molecular Typing of Campylobacter jejuni and Campylobacter coli Isolates from Ducks in South Korea.[J].Appl Environ Microbiol， 2014，80（24）：7604.

[12] 韩新锋，刘书亮，张晓利，等.鸡肉空肠弯曲杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J].中国人兽共患病学报，2012，28（1）：31-36.

[13] ALFREDSON DA， KOROLIK V. Antibiotic resistance and resistance mechanisms in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli[J].FEMS Microbiol Lett，2007，277：123-132.

[14] ZHANG Q， PLUMMER P J. Mechanisms of antibiotic resistance in Campylobacter[M].England： ASM Press， 2008.

[15] HONG J，KIM J M，JUNG W K，et al. Prevalence and antibiotic resistance of Campylobacter spp iaolated from chicken meat， pork and beef in Korea from 2001 to 2006[J]. Journal of Food Protection，2007，70（4）：860-866.endprint