李辉 岳先领 李皓 侯鹏娟 张峻松

摘要：为了研究离子色谱法测定烟叶中游离氨基酸含量，以游离氨基酸测定总量为指标，考察了萃取所用的溶剂、温度、时间以及料液比等因素对游离氨基酸测定量的影响。结果表明，烟草中游离氨基酸的最优检测条件为：萃取溶剂为0.1 mol/L盐酸、萃取时间为30 min、萃取温度为30 ℃、烟叶与盐酸的比例为1∶40（w/v）。测定方法的氨基酸检出限为2.76～22.36 ng/mL，定量限为9.57～102.13 ng/mL，试验的RSD为1.26%～4.96%，氨基酸的加标回收率为83.51%～106.78%，说明该优化方法可行，利用确定的最佳条件测定了国内主产区的10种烤烟型烟叶。

关键词：烟草;游离氨基酸;离子色谱;测定

中图分类号：O656.3        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）23-6023-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.058

Determination of Free Amino Acids in Tobacco by Ion Chromatography Method

LI Hui1，YUE Xian-ling1，LI Hao2，HOU Peng-juan2，ZHANG Jun-song2

（1.Technology Center of Heilongjiang Tobacco Industry Co.，Ltd.， Harbin 150001， China;

2.College of Food and Bioengineering Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002， China）

Abstract： In order to study the effect of ion chromatography method for the determination of free amino acids in tobacco， the optimization of the experimental conditions were studied， the value of free amino acids used as a response value. The experimental results showed that the best experimental conditions were as follows： the extract solvent was 0.1 mol/L hydrochloric acid; the temperature of experiment was 30 ℃; the extract time was 30 min; the solid to liquid ratio was 1∶40（w/v）. The detection limit of the method was 2.76～22.36 ng/mL，limit of quantitation was 9.57～102.13 ng/mL， the method has high recovery（83.51%～106.78%）and good repeatability （RSD<5%）， these results demonstrate that this method is feasible. The contents of free amino acids in 10 flue-cured tobaccos were determined.

Key words：tobacco;free amino acids;ion chromatography;determination

游离氨基酸是烟草中的一类重要化合物，约占烟叶重量的0.5%～2.1%[1]，在烟草生长、烘烤、陈化、工艺加工以及燃烧的过程中参与化学反应，并生成许多种具有不同香味特征的化合物，与烟叶内或外加的还原糖发生缩合以及缩合物的进一步降解，生成一系列的吡咯、吡嗪和呋喃类等碱性香味化合物，这些碱性香味成分对烟草的香气、吸味等感官质量产生显著影响[2，3]。某些氨基酸也可以自身分解，生成具有香味的化合物，因此烟叶中游离氨基酸的种类数量以及烟叶中各种氨基酸的含量的多少与烟叶品质的好坏有着重要的相关性[4，5]。

研究发现，烟叶中适量的氨基酸可有助于提高相应卷烟烟气劲头以及增加其烟气的丰满度，但是若烟叶中氨基酸含量过于偏高，会使相应卷烟烟气产生过于辛辣的口感，并且味苦、刺激性强烈，含量过低则会使烟气趋于平淡无味，丰满程度变差，因此烟草中氨基酸含量的多少对其感官质量有重要的影响[6-8]。为此利用离子色谱测定烟草中游离氨基酸，以期为卷烟工业合理利用烟叶原料提供科学依据。

1  材料与方法

1.1  材料与仪器

试验所用烟叶均为黑龙江烟草工业有限责任公司技术中心提供;17种氨基酸标样（>99%，百灵威公司）;无水醋酸钠（>99.9%， Dionex公司）;氢氧化钠和氨水（AR，中国医药集团上海化学试剂公司）;37%盐酸（ACROS公司）;SPE SCX 4 mL/200 mg强阳离子交换固相萃取小柱;0.45 μm水相滤膜（津腾）。

HZ-F185型旋转恒温震荡器（太仓试验设备厂）;ICS-5000+型分析型多功能离子色谱（美国戴安公司）;RE-52AA型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2  试验方法

1.2.1  烟叶样品的制备

根据中国烟草行业标准[9]，对烟叶样品进行了制备，并根据国家标准对其含水量进行测定。将烟叶自然风干后粉碎，过0.5 mm筛网后置于广口瓶中保存。

1.2.2  氨基酸标准溶液的配制

混合氨基酸标准储备液（2.5 μmol/mL）用电子天平准确称取赖氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、谷氨酸、胱氨酸、丝氨酸、脯氨酸、组氨酸、亮氨酸、天冬氨酸和酪氨酸等样品（精确至0.1 mg）置于小烧杯中，加入少许0.1 mol/L盐酸使其完全溶解，然后将烧杯中的混合氨基酸溶液转移至100 mL容量瓶，用0.1 mol/L稀盐酸定容至刻度线，即配成混合氨基酸储备液，其浓度为2.5 μmol/mL。

氨基酸标准溶液的配制：用盐酸萃取溶剂对上述配置好的17种2.5 μmol/mL的氨基酸储备液进行逐级稀释，所得到的标准溶液的浓度分别为4、20、50、125、250、2 500 nmol/mL。

1.2.3  烟叶样品的前处理方法

准确称取1.0 g烟草粉末样品（精确至0.1 mg）置于100 mL锥形瓶中，加入一定体积盐酸提取溶液，具塞后放置于恒温震荡培养箱中进行振荡萃取，震荡完成后将萃取液经滤纸过滤，除去烟草样品粉末，再准确移取2 mL滤液，混合均匀，离心30 min，然后过阳离子固相萃取小柱，对萃取溶液进行纯化。

1.3  离子色谱分析条件

色谱柱：氨基酸阴离子交换柱（250 mm×2 mm）;柱温为32 ℃;流速为0.25 mL/min;进样量为25 μL;

流动相A为水;流动相B为250 mmol/L氢氧化钠溶液;流动相C为1 mol/L醋酸钠溶液;梯度洗脱程序如表1所示。

1.4  游离氨基酸的定性、定量方法

采用与标准样品相对保留时间比较对各游离氨基酸进行定性，采用外标工作曲线法定量。

2  结果与分析

2.1  氨基酸的工作曲线

对上述所制得的17种氨基酸标准工作溶液用离子色谱脉冲安培法进行测定，分别得到不同种类氨基酸相应的积分峰面积，然后以不同种类氨基酸相应的峰面积为纵坐标（y），以17种氨基酸的浓度为横坐标（x）建立校正曲线。得到各游离氨基酸线性方程及相关系数，各成分的R2为0.995 2～0.999 9，表明工作曲线线性关系良好，适用于游离氨基酸的定量计算。

2.2  试验条件对氨基酸测定结果的影响

2.2.1  萃取溶剂对测定结果的影响

大部分的氨基酸可在水中溶解，仅有几种在水中的溶解度稍差，可用稀盐酸溶液振摇萃取。因此对烟叶中氨基酸的萃取采用稀盐酸溶液，分别选用0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mol/L盐酸溶液和0.1 mol/L的盐酸-乙醇溶液（50∶50，V/V），结果表明，0.1 mol/L的盐酸-乙醇（50∶70，V/V）萃取溶液由于含有一定量的乙醇，而乙醇在脉冲安培检测器上有一定的响应值，从而干扰氨基酸的定量检测结果;利用不同浓度的盐酸溶液对烟草样品中的游离氨基酸的萃取效果有较大影响，试验结果如图1所示。

由图1可知，随着盐酸浓度的增加烟叶中游离氨基酸总量测定值也随之增加，当盐酸溶液浓度大于0.08 mol/L时，萃取烟草和烟草样品中游离氨基酸的稳定性和萃取效率均好，当浓度达到0.10 mol/L时游离氨基酸总量最大，因此从萃取效率和稳定性最佳角度考虑，试验选择0.10 mol/L盐酸溶液作为萃取溶剂。

2.2.2  萃取时间对氨基酸测定结果的影响

为选择合适的萃取时间，准确称取1.0 g烟末样品，保持其他测试条件不变，分别选择振荡萃取为5、10、20、30、40、50 min进行试验，结果见图2。

由图2可知，随着萃取时间的增加，在20 min之前游离氨基酸总量测定值也随之增加，在20 min以后萃取时间对萃取的效率影响不大，由于考虑到不同的烟叶样品之间存在差异性，本试验选择游离氨基酸的最佳萃取时间为30 min。

2.2.3  萃取温度对测定结果的影响

为选择合适的萃取温度，准确称取1.0 g样品各6份，保持其他条件不变，分别设定萃取温度为20、25、30、35和40 ℃进行试验，结果如图3所示。

由图3可知，随着萃取温度的升高游离氨基酸的测定值也随之增加，当温度达到30 ℃时测定值达到最大，之后游离氨基酸的总量有所下降。主要原因是随着温度的增加会促进烟叶的美拉德反应，而导致氨基酸的测定结果偏低。

2.2.4  料液比对测定结果的影响

为选择合适的料液比，准确称取1.0 g样品各6份，保持其他因素不变，分别选取烟末和0.10 mol/L盐酸的比例为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（w/v）进行试验，结果如图4所示。

由图4所知，随着料液比的升高游离氨基酸的测定值也随之增加，当料液比为1∶40（w/v）时测定值达到最大，之后游离氨基酸测定值有所下降。主要原因是因为反应时间过长高级脂肪酸会破坏，导致测定值偏低。

2.3  方法的检测限

本试验选取标准曲线中的最低浓度进行连续重复10次进样，将10次进样测定结果的峰面积代入相应标准曲线的线性回归方程中，求出对应的浓度值，再对其10次测定计算得出的浓度值进行标准偏差（SD）的计算，分别以3倍标准标准偏差和10倍标准标准偏差计算得到的值为本方法的检出限和定量限，结果见表2。

2.4  方法的重复性

试验选择同一烟末样品，按照前述优化后的方法进行6次平行前处理，结果表明各游离氨基酸的RSD为4.96%～1.26%，表明该方法的重复性较好，可满足氨基酸的定量分析。

2.5  样品的加样回收率

选用标准品溶液对样本进行不同浓度水平的加标后，依照前面所确定的前处理方法，最终根据加标回收试验计算其加标回收率，加标回收率为83.51%～106.78%，满足定量分析要求。

2.6  样品的测定结果

利用优化后的离子色谱法测定游离氨基酸的试验条件，分别对国内云南、河南、四川、贵州等10个烤烟型叶中的游离氨基酸进行了测定。试验结果表明，在所分析的烟叶中，氨基酸总量分布范围为8.75～15.35 mg/g，其中烟叶中所含脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸的含量相对较高。

3  小结与讨论

1）以游离氨基酸总量为考察指标，明确了离子色谱法测定烟草中游离氨基酸的最优试验条件为：萃取用溶剂为0.10 mol/L的盐酸、萃取时间为30 min、萃取温度为30 ℃、烟叶于盐酸的比例为1∶40。

2）对试验方法的准确性进行了研究，结果表明，测定方法的氨基酸检出限为2.76～22.36 ng/mL，定量限为9.57～102.13 ng/mL，试验的RSD为1.26%～4.96%，氨基酸的加标回收率为83.51%～106.78%，说明该方法可满足对烟叶中游离氨基酸的分析，并利用该方法对国内主产区的10种烟叶中的游离氨基酸进行了分析，结果表明，烟叶中所含脯氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等氨基酸含量较高。

参考文献：

[1] JOMITA H，NOGVCHI M，TAMAKI E.Chemical studies on positive compounds in cured tobacco leaves III–Further isolation and identification of some amino acid-sugar compounds[J].Agr Biol Chem，1965，29：959-961.

[2] 周冀衡，朱小平，王彦亭，等.烟草生理与生物化学[M].合肥：中国科学技术出版社，1996.

[3] 邓国宾，曾晓鹰，薛红芬，等.烤烟游离氨基酸与感官质量的相关性研究[J].中国烟草科学，2011，32（5）：14-23.

[4] WEYBREW J A，WAN ISMAIL W A，LONG R C. The cultural management of flue-cured tobacco quality[J].Tobacco international，1983，185（10）：82-87.

[5] PRAHU S R，CHAKRABORTY M K，NAGARAJ G. Radioactive tracer studies on carbonyl generation in flue-cured tobacco[J].Tob Int，1984，186（3）：45-47.

[6] LEFFINGWELL J C，LEFFINGWELL D. Chemical and sensory aspects of tobacco flavor[J]. Rec Adv Tob Sci，1988，14：169-218.

[7] 李广良，景延秋，刘剑君，等.不同种植密度对白肋烟游离氨基酸含量的影响[J].南方农业学报，2011，42（6）：599-602.

[8] 柴家荣.砍收期与白肋烟游离氨基酸含量变化及品质的关系[J].中国烟草科学，2010，31（4）：39-43.

[9] YC/T 31-1996，烟草及烟草制品试样的制备和水分测定烘箱[S].