王慧颖+王曼+朴世领+金爱兰+陈爽

摘要： 以吉林省常见的23份晒烟和2份烤烟为试材，利用形态学标记和SSR分子标记两种方法进行遗传距离的研究，并将所得的遗传距离进行相关性分析。结果表明，晒烟材料的形态学欧氏距离在1.11～8.29之间，欧氏距离较小，说明各晒烟品种间遗传基础狭窄。通过SSR标记法，得到各晒烟材料间的遗传背景较相似，遗传相似系数为0.51～0.98，相似性较大，说明亲缘关系较近。两种方法的聚类分析结果基本一致。利用SPSS软件对形态学欧氏距离与SSR遗传相似系数进行了相关性分析，结果呈极显著负相关，相关系数为r=-0.383。由此可见，分子标记能反映烟草品种间的遗传变异，通过这种简便快捷的标记方法，能够提高烟草育种效率。

关键词：晒烟;形态学标记;SSR标记;亲缘关系;遗传多样性;相关性分析

中图分类号：S572        文献标识码：A        文章编号：0439-8114（2015）23-5943-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.038

The Genetic Diversity Analyses on Sun-cured Tobacco Germplasm by Morphological Markers and SSR Markers

WANG Hui-ying1， WANG Man1， PIAO Shi-ling1， JIN Ai-lan2， CHEN Shuang1

（1.Agricultural College，Yanbian University，Yanji 133002，Jilin，China;2.Yanbian Academy of Agricultural Sciences，Longjing 133400，Jilin，China）

Abstract： Taking 23 common sun-cured tobaccos and 2 flue-cured tobaccosof Jilin province as test materials， combining with morphological markers and SSR markers， the correlation of genetic distance was analyzed. Results showed that， morphology euclidean distance of sun-cured material was 1.11～8.29， which showed genetic base among sun-cured tobacco varieties was relatively narrow. Genetic backgrounds between each sun-cured materials were similar through SSR markers， the genetic similarity coefficient was 0.51～0.98. Cluster analysis results of the two methods were basically the same. The correlation analysis between morphology euclidean distance and SSR genetic similarity coefficient was conducted by SPSS software， a significant negative correlation was obtained with correlation coefficient  r=-0.383. It was concluded  that molecular markers could reflect the genetic variation among breeds， andimprove the breeding efficiency.

Key words：sun-cured tobacco;morphological markers;SSR markers;genetic relationship; genetic diversity;correlation analysis

吉林省晒烟作为中国名晒烟之一，以色泽鲜明、吃味纯净、油分充足、香气优雅浓郁、焦油释放量低等特点在中国享有很高的声誉[1]。但后来盲目追求产量、忽视质量、科研投入少，没有开展深层次的科学研究，致使种质间遗传基础狭窄，烟叶内在质量差，生产规模萎缩[2]，阻碍了烟草产量和质量的进一步提高[3]。加之长久以来，种烟户自由种植，导致优质品种逐渐退化，出现品种混杂现象，严重影响了吉林省晒烟声誉，挫伤了烟农种烟积极性。为此，探索种质资源之间的遗传多样性和建立核心种质资源库非常必要。

形态标记为一种操作简单、直观、便于观察的遗传标记，是人们最早利用的遗传标记[4]。牛佩兰等[5]、肖炳光等[6]先后利用形态学标记对遗传距离进行测定和聚类分析，证明了形态学标记遗传多样性的可行性。SSR（Simple Sequence Repeat，简单序列重复）标记是建立在 PCR 技术上的 DNA标记，其操作相对简单、获得结果快速且不受试验环境条件的影响。陈杰[4]再次证明了SSR分子标记技术对遗传多样性研究的结果具有较高的准确度，能很好地揭示其亲缘关系。目前，SSR分子标记技术已被广泛用于烤烟种质资源遗传多样性检测、品种鉴定和亲缘关系的研究[7]，但针对吉林省特定生态区域晒烟的研究甚少。为此，本研究利用形态学标记和SSR分子标记对晒烟种质资源进行了遗传多样性分析，以期为吉林省晒烟种质资源的合理利用和优良新品种的选育提供一定的依据。endprint

1  材料与方法

1.1  材料

以吉林省常见的23份晒烟（1～23号）和2份烤烟（24～25号）品种为试验材料。品种及编号：①五十叶、②红花铁矮子、③光兴烟、④牡丹池烟、⑤吉林琥珀香、⑥元峰烟、⑦小马稀、⑧大马稀、⑨风林一号、⑩红花矮子、■孟山草、■大护耳柳叶尖、■仲成五十叶、■杰满烟、■延晒一号、■延晒二号、■“8107”、 18延吉自来红、 19延吉千层塔、  20太兴烟、

21延边红、 22牡丹一号、  23松川（关东201）、  24云烟87、25吉烟九号。供试材料种子取自吉林省延边朝鲜族自治州农业科学院烟草研究所。所有烟草材料种植于延边大学农学院烟草试验基地，每个品种种植60株。

1.2  试剂和仪器

植物基因组DNA提取试剂盒购自南京奥多福尼生物科技有限公司;10×buffer、Marker、25 mmol/L Mg2+、Taq酶、dNTP和琼脂糖凝胶均购自大连宝生物工程有限公司;试验采用Bindler等[8]发表的引物序列，由上海生物工程技术服务有限公司合成。引物用灭菌双蒸水稀释成10 pmol/μL备用。

DYY-12型电泳仪、电泳槽（北京六一仪器厂）;PCR梯度扩增仪、全自动凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）;LX—100手掌型离心机（海门市麒麟医用仪器厂）;水浴锅;台式离心机（合肥名威科技发展有限公司）;Sanyo MDF-U73V型超低温冰箱（上海旦鼎国际贸易有限公司）等。

1.3  试验方法

1.3.1  各品种烟叶的形态学性状指标分析

1）烟叶农艺性状的测定。分别测定各品种的株高、茎围、叶数、节距、叶长、叶宽（每品种定10株记载植物学性状，求平均值），并观察不同品种的株型、叶形、叶色和花色。具体参照中华人民共和国烟草行业标准（YC/T 142-2010）进行。

2）烟叶主要化学成分的测定。打顶后10 d，选取有代表性的烟株3株，分别取上部、中部、下部新鲜叶片若干作为测定材料，取样后用液氮保存并迅速送实验室进行杀青30 min，然后烘干、研碎过筛，装入塑料袋中做好标签密封，保存备用。分别测定总糖、还原糖[9]、烟碱[10]、总氮[11]和蛋白质含量[10]，形态学性状的统计每份材料的每个性状重复测定3次。

1.3.2  SSR-PCR反应体系及检测方法

采用植物基因组DNA试剂盒提取法提取DNA。晒烟的SSR-PCR反应体系为：20 μL体系中含10×PCR buffer 2 μL，模板DNA 20 ng，引物0.25 μmol/L，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，Taq酶1.5 U，ddH2O 10.1 μL。PCR反应条件为预变性：95℃ 5min;95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s（视引物而变），72 ℃ 50 s，40个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存备用[12]。

取不同品种的PCR扩增产物15 μL分别与3 μL溴酚蓝混匀，依次点入2%琼脂糖凝胶胶口中，电泳后用EB染色，然后在美国BIO-RAD全自动凝胶成像仪上照相观察。

1.3.3  数据处理与统计分析

利用SPSS软件对25份供试材料的6个农艺性状和5种化学成分指标进行标准化处理，然后按欧氏距离、离差平方和法进行系统聚类分析[13]，并绘制树状图。对于SSR带型，在相同迁移率的位置上，对每个位点上的条带进行计数，有带记为“1”，无带记为“0”。数据分析采用NTSYS2.10软件，聚类分析用类平均法UPGMA（Un weighted pair-Group Method with Arithmetic mean）程序进行，首先计算出任意两个材料间的遗传相似系数，然后获得相应的遗传树状图[14]。将表型性状获得的遗传距离矩阵与SSR分析获得的遗传相似系数矩阵数据输入SPSS软件，对二者进行形态学欧氏距离与SSR遗传相似系数的相关性分析。

2  结果与分析

2.1  形态学标记结果与聚类分析

25份品种间的欧氏距离列于表1，欧式距离越大，遗传差异性越大。试验结果表明，两份烤烟材料与晒烟各品种间的欧氏距离均较大，介于7.44～10.58之间，说明不同烟草类型间的遗传差异性较大，其中烤烟云烟87与晒烟吉林琥珀香的遗传差异性最大，欧式距离为10.58;两份烤烟之间的欧氏距离仅为0.87，说明二者在25份供试材料中的亲缘关系最近;23份晒烟之间的欧氏距离以延吉自来红和延吉千层塔最小，为1.11，说明二者在23份供试晒烟中的亲缘关系最密切，而亲缘关系最远的两份晒烟是牡丹池烟和“8107”，欧氏距离为8.29。

由形态学指标树状图（图1）可知，烤烟与晒烟间的遗传相似性较低，当欧氏距离取值为11时，可以明显地将它们区分成两大类，即Ⅰ1和Ⅰ2，当欧氏距离取值为8时，可将所有的晒烟系列（Ⅰ2）进一步分成两个亚类（Ⅱ1、Ⅱ2）。第一亚类（Ⅱ1）包括延吉自来红、延吉千层塔、仲城五十叶、吉林琥珀香、红花矮子以及孟山草，第二亚类（Ⅱ2）包括其他的17份晒烟品种，总体来看，供试晒烟品种间的遗传基础较为狭窄。

2.2  SSR的遗传多样性分析

用已筛选出的10对SSR引物对所有供试品种进行PCR扩增，在分子量为200～1 000 bp范围内，10对引物在25份供试材料中共扩增出52条带，其中有44条带是多态性条带，占总带数85%，表明不同供试种质之间遗传多态性丰富，另外8条是所有品种共有的条带，这在一定程度上揭示了各烟草种质间的同源性，同时也证实了SSR分子标记法用于烟草品种亲缘关系分析的可靠性。图2为引物PT20306对所有供试品种的扩增结果。endprint

2.3  25份供试品种间的遗传相似系数及聚类分析

利用NYSTS软件对所有供试品种之间的遗传相似系数进行了统计（表2）。结果表明，相似性系数越大，亲缘关系越近。23份供试晒烟的遗传相似系数介于0.531～0.980之间，平均相似系数为0.744，说明供试晒烟间的遗传相似性较大，亲缘关系较近，其中吉林琥珀香、元峰烟和小马稀三者之间表现最明显，而松川（关东201）虽为日本引进种质资源，但它与其他地方性晒烟种质的遗传相似性较高，在杂交方面并不具备优势，23份晒烟种质与供试烤烟间的遗传相似性系数平均值为0.627，亲缘关系相对较远，其中表现最明显的是红花铁矮子、延晒二号与云烟87之间，可能是不同烟属和不同地区栽培环境造成的，而云烟87与吉烟九号同属于烤烟，因此遗传关系相对较近，相似系数为0.857。

为了更直观地看出25个供试品种在基因组上的遗传关系，利用UPGMA法对所有供试品种的遗传相似系数矩阵进行聚类分析，构建了不同烟草品种间的树状图（图3）。试验表明，两份烤烟与其他晒烟在第一等级划分时就被明显的划分成两大类群（Ⅰ1、Ⅰ2），它们间的遗传相似性最小，仅为0.628，第二等级划分（L2=0.690）可以将Ⅰ2进一步划分为两大亚类。

第一亚类（Ⅱ1）包括9个品种，分别为红花矮子、仲成五十叶、太兴烟、孟山草、牡丹一号、松川（关东201）、延晒一号、8107、延边红，组内遗传相似系数介于0.698～0.898之间。

第二亚类（Ⅱ2）包括14个晒烟品种，即五十叶、红花铁矮子、杰满烟、吉林琥珀香、元峰烟、小马稀、风林一号、大护耳柳叶尖、延晒二号、延吉千层塔、大马稀、光兴烟、延吉自来红、牡丹池烟，组内遗传相似系数为0.726～0.980之间。

第三等级划分（L3=0.7），可在第二等级划分结果不变的情况下再将第一亚类（Ⅱ1）划分成两个小亚类，即Ⅲ1、Ⅲ2，其中Ⅲ1包括红花矮子、仲成五十叶、太兴烟、孟山草、牡丹一号和松川（关东201），Ⅲ2包括其他3份晒烟延晒一号、“8107”和延边红。

由此可见，两份烤烟与其他晒烟品种之间有较好的分辨能力，较早地就形成了两个不同的分支，而晒烟种内遗传基础相对狭窄，尤其是吉林琥珀香与元峰烟之间的遗传相似性最大。

2.4  形态学欧氏距离与SSR遗传相似系数的相关性分析

为了检测同组供试材料基于形态学标记和SSR分子标记分析结果的相关程度，本研究利用SPSS软件对形态学欧氏距离与SSR遗传相似系数进行了相关性分析，结果呈极显著负相关，相关系数为r=-0.383，为进一步探讨形态学欧氏距离与SSR遗传相似系数确定不同品种遗传差异的一致性程度，又将化学成分组合和农艺性状组合所得到的欧氏距离分别与SSR分析得到的遗传相似系数进行相关分析，结果均表现为极显著负相关，其相关系数分别为r=-0.366和r=-0.265。

3  小结与讨论

从形态学标记和SSR分子标记分析比较来看，两者结果总体上一致，但存在一定的差异。两种方法均说明了供试晒烟品种间遗传相似性较大、遗传基础狭窄，经相关性检测，形态学欧氏距离与SSR遗传相似系数呈极显著负相关，相关系数为     r=-0.383。这不仅说明SSR分子标记应用于烟草遗传关系分析的可靠性，也反映了本研究所选用的形态学标记法在品种资源鉴定中的合理性。这一点在朱慧丽[15]的研究中也有所体现，但相关性结果与本试验稍有不同，可能是由于供试烟草类型不同、分子标记方法亦不同引起的。与SSR聚类结果相比，形态学标记稍有不同，如延晒一号和延晒二号是两个遗传背景不同的品种，在SSR标记中得到了证实，但形态学标记并未将它们区分开，又如吉林琥珀香和元峰烟在形态学标记中是被分到两个不同的晒烟大亚类中，但在SSR标记中，它们却是最先被聚成一类的，亲缘关系最近。造成这种差异的原因可能是形态学标记受环境和人们主观因素影响较大。实际上，形态学差异和分子水平的差异所经受的进化压力不同，遵循的规律也不同，彼此是相互独立的[16]，形态学上的差异并不一定是DNA水平变异的真实反映[17]，换句话说，肉眼可观察到的形态学性状的差异在SSR标记检测的多态性位点上并不一定都能表现出来。为此，可以有针对性地设计引物，使之覆盖面广，将形态学性状上表现差异的位点都以SSR等位位点的形式检测出来，最终达到两种标记的协同统一。

综上所述，SSR标记法更利于育种工作者进行早期鉴定，明确各品种遗传关系，从而缩短育种年限，加快育种步伐，提高育种效果，且该标记方法更符合植物学分类的结果。总而言之，SSR分子标记法是比形态学标记更优的遗传多样性分析方法。

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