匡重伸许航黄征朱桂云王胜

钙蛋白酶抑制剂减少大鼠局灶性脑缺血再灌注模型海马CA1区神经元凋亡*

匡重伸①许航①黄征①朱桂云①王胜①

目的：研究钙蛋白酶抑制剂calpeptin干预治疗对大鼠局灶性脑缺血再灌注模型海马CA1区神经元凋亡的影响及其可能机制。方法：选择健康成年雄性SD大鼠128只作为研究动物，采用随机数字表法将其分为MACO组、calpeptin组、DMSO组及sham组，制作大鼠左侧大脑中动脉缺血再灌注模型，缺血2 h后分别再灌注6、12、24 h及48 h后进行神经功能学评分，免疫组化检测海马CA1区神经元caspase-3的表达，TUNEL法检测原位细胞凋亡，观察海马CA1区神经元凋亡。结果：DMSO组的各项检测指标与MACO组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；calpeptin组的神经功能评分及caspase-3表达均低于同时间点MCAO组及DMSO组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；再灌注12、24、48 h后，calpeptin组神经元凋亡情况优于同时间点MCAO组及DMSO组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论：calpeptin可减少大鼠局灶性脑缺血再灌注模型海马CA1区的神经元凋亡，对脑缺血再灌注损伤有保护作用，其机制可能与抑制caspase-3的表达有关。

钙蛋白酶； 缺血再灌注损伤； 凋亡； caspase-3

随着对缺血性脑损伤分子机制的深入了解，发现半胱氨酸蛋白酶家族成员钙激活中性蛋白酶（calpain）在缺血性脑损伤中起重要作用，众多研究表明，脑缺血后calpain大量被激活，激活后的calpain可通过多种途径导致神经元坏死，许多证据表明calpain也参与了缺血后神经元的凋亡[1]。本实验采用大鼠大脑中动脉栓塞实验动物模型及侧脑室注射技术，研究钙蛋白酶抑制剂calpeptin对缺血再灌注后不同时相缺血侧海马CA1区神经元凋亡、caspase-3表达及其对大鼠神经功能的影响，现具体报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠128只，体重250～280 g，由石河子大学实验动物中心提供。采用随机数字表法将其分为四组，即缺血再灌注对照组（MACO组）、calpeptin治疗组（calpeptin组）、溶剂二甲基亚砜对照组（DMSO组）及假手术组（sham组），每组32只。每组又分为6、12、24和48 h四小组，每组8只。

1.2 方法

1.2.1 给药方法 钙蛋白酶抑制剂calpeptin购自calbiochem公司，二甲亚砜（DMSO）购自sigama公司。手术前大鼠用3.6%的水合氯醛（360 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯卧固定于脑立体定位仪上，暴露前囟，调节微调旋钮，使微量注射器针尖正对左侧侧脑室（前囟左侧1.8 mm，后0.8 mm），钻孔，将微量注射器下移至软脑膜，缓慢进针4.5 mm，calpeptin组制作MACO前左侧侧脑室注射calpeptin 50 μg（溶于二甲基亚砜5 μL中）；DMSO组MACO术前左侧侧脑室注射DMSO 5μL，注射时间5 min，留针5 min，注射后即进行造模手术。

1.2.2 MCAO模型的建立 参照Belayev等[2]改良的Longa方法，大鼠侧脑室给药后，在室温（25 ℃）条件下，仰卧固定于手术台上，颈部正中切口，分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）及翼腭动脉（不结扎该动脉），保护迷走神经、膈神经及气管，结扎ECA近端，结扎CCA近心端，在CCA近动脉分叉处剪一小口后插入末端沾有石蜡的直径为0.25 mm（4-0）尼龙线，插入深度距CCA分叉处（18.0±1.0）mm，此时有轻度的阻力感，扎紧CCA及其内的尼龙线，假手术组尼龙线插入的深度为10 mm，其余步骤相同，手术期间用100 W的白炽灯照射，保持大鼠肛温在36.5～37.5 ℃。2 h后小心拉出尼龙线10 mm即造成再灌注模型，再次扎紧CCA及其内的尼龙线。

1.2.3 神经功能评价 大鼠麻醉清醒后，参考Bederson等[3]5分制评分标准在相应的时间点对其进行神经功能评定，0分：无神经损伤体征；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。分值越高说明大鼠行为障碍越严重。

1.2.4 切片标本制备 实验动物在设定时间点神经功能评分后经10%的水合氯醛腹腔麻醉后，依次用4 ℃生理盐水200 mL及4 ℃ 4%多聚甲醛400 mL经左心室升主动脉灌注，灌注完立即断头取脑，置4%多聚甲醛中后固定10 h，酒精梯度脱水，石蜡包埋，在海马与齿状回互抱处取材，每隔100 μm连续6 μm切片6张，切片贴附于预处理的载玻片上，用前脱蜡至水。相邻切片分别行原位细胞凋亡、caspase-3检测。

1.2.5 caspase-3活性蛋白检测 切片脱蜡至水，滴加3%H2O2室温20 min，蒸馏水洗3 min×3次，微波修复抗原；滴加牛血清封闭液，室温20 min，甩去多余液体，不洗；滴加Ⅰ抗（兔抗大鼠caspase-3单克隆抗体），37 ℃孵育120 min，PBS洗3 min×3次；滴加Ⅱ抗（生物素标记羊抗兔IgG），37 ℃孵育30 min，PBS 洗3 min×3次；滴加试剂SABC，37 ℃孵育20 min，PBS洗5 min×4次；DAB显色，PBS洗涤，苏木素轻度复染、脱水、透明、封片、显微镜观察。胞浆着色呈棕黄色为阳性细胞。

1.2.6 原位细胞凋亡检测 用TdT介导的dUTP缺口末端标记技术[terminal deoxynucleotidyl transferase （TdT）-mediated dUTP nick end-labeling，TUNEL]检测大鼠缺血侧海马CA1区的神经元凋亡，TUNEL试剂盒购自博士德公司。具体操作方法按说明书进行，即经过氧化氢/甲醇、柠檬酸钠处理后，滴加TUNEL反应混合液，37 ℃孵育60 min，随后滴加过氧化物酶标记的抗荧光抗体，37 ℃孵育30 min。最后滴加DAB显色底物，室温、避光，显微镜下控制染色深浅。常规脱水、透明、封片。每一批实验中设立阳性对照和阴性对照。阳性对照为在TUNEL标记反应前用DNaseⅠ（1 mg/mL）37 ℃温箱孵育切片20 min，结果细胞核呈阳性。阴性对照为TUNEL标记反应液中省去TUNEL反应混合液，而只加标记液，结果细胞不显色。在高倍镜（×400）下观察海马CA1区中相互不重叠的4个视野，计数其中阳性细胞数，取均值。

1.3 统计学处理 所得数据用SPSS 17.0统计软件包进行统计分析，计量资料以（±s）表示，比较采用t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠神经功能学评分比较 sham组大鼠苏醒后未见明显的神经功能学缺失；MCAO组再灌注24 h神经功能缺失最严重。DMSO组神经功能评分与MCAO组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；calpeptin组神经功能评分低于MCAO组及DMSO组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 各组海马CA1区caspase-3表达情况比较 sham组的caspase-3表达很少；DMSO组caspase-3表达与同时间点MCAO组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；calpeptin组caspase-3表达低于同时间点MCAO组及DMSO组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

2.3 海马CA1区神经元凋亡情况比较 sham组的神经元凋亡很少，MCAO组在缺血2 h再灌注6 h有少量的神经元凋亡，在24 h达高峰，DMSO组神经元凋亡情况与同时间点MCAO组比较，差异无统计学差异（P＞0.05）；再灌注12、24、48 h后，calpeptin组神经元凋亡情况优于同时间点MCAO组及DMSO组，比较差异均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表1 各组大鼠不同时间点神经功能评分情况比较（±s） 分

表1 各组大鼠不同时间点神经功能评分情况比较（±s） 分

*P＜0.05，**P＜0.01，与MCAO组同时间点比较；△P＜0.05，△△P＜0.01，与DMSO组同时间点比较

组别 6 h 12 h 24 h 48 h MCAO组（n=32） 2.50±0.53 2.63±0.52 2.75±0.46 2.38±0.52 DMSO组（n=32） 2.63±0.52 2.50±0.76 2.63±0.74 2.38±0.74 calpeptin组（n=32） 1.75±0.71*△ 1.75±0.46*△ 1.50±0.53**△△ 1.63±0.74*△

表2 各组不同时间点caspase-3表达情况比较（±s）

表2 各组不同时间点caspase-3表达情况比较（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01，与MCAO组同时间点比较；△P＜0.05，△△P＜0.01，与DMSO组同时间点比较

组别 6 h 12 h 24 h 48 h sham组（n=32） 1.75±0.41 1.68±0.35 1.82±0.45 1.71±0.38 MCAO组（n=32） 13.75±4.23 30.13±6.33 50.13±12.92 36.13±10.67 DMSO组（n=32） 14.50±4.38 29.63±5.51 52.63±13.18 37.5±12.44 calpeptin组（n=32） 9.25±3.73*△ 22.63±7.48* 35.75±11.93**△△ 24.38±10.46*△

表3 各组不同时间点神经元凋亡情况比较（±s）

表3 各组不同时间点神经元凋亡情况比较（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01，与MCAO组同时间点比较；△P＜0.05，△△P＜0.01，与DMSO组同时间点比较

组别 6 h 12 h 24 h 48 h sham组（n=32） 1.55±0.38 1.48±0.32 1.61±0.41 1.57±0.35 MCAO组（n=32） 4.63±1.58 26.50±7.19 44.75±13.44 33.50±9.65 DMSO组（n=32） 4.15±1.78 27.75±6.23 45.63±13.15 31.25±8.07 calpeptin组（n=32） 2.75±1.82 16.75±5.63**△△ 30.75±11.79*△ 21.25±5.97**△

3 讨论

大量研究表明，脑缺血可引起如下神经损伤级联反应：兴奋性氨基酸自突触前膜大量释放；谷氨酸受体过度激活引起大量Ca2+释放入胞浆；导致细胞内Ca2+超载；细胞内Ca2+超载使依赖于Ca2+的胞内蛋白类（包括钙调蛋白、蛋白激酶C、calpain、磷脂酶C和A2、一氧化氮合酶）被过度激活；激活的蛋白与酶类启动或参与细胞病理损伤，最终导致细胞死亡[4]。calpain在缺血性脑损伤中起着重要的作用而倍受关注，是近年来研究的热点之一[5]。calpain是半胱氨酸异二聚体蛋白酶，由一个催化亚单元（80 kD）和一个调节亚单元（29 kD）组成，分为calpainⅠ（又称μ-calpain）和calpainⅡ（m-calpain）两种类型，二者的调节亚单元相同，催化亚单元不同，激活所需的Ca2+浓度不同，可分别被微摩尔和毫摩尔水平的Ca2+激活[6]。在生理状态下，calpain以酶原的形式存在于细胞质中，在病理情况下（如缺血等），细胞内Ca2+超载，Ca2+与calpain催化区的特异性钙调蛋白样位点结合引起构象改变，从而使其激活[7]。激活后的calpain可水解关键的细胞骨架蛋白（如MAP2、spectrin、tubulin以及ankylin）而导致细胞死亡[8]。Yamashima等[9]研究发现猴子短暂性全脑缺血后，海马CA1区神经元内μ-calpain大量激活，激活后的μ-calpain可水解溶酶体膜连接蛋白（lamp-1），导致溶酶体破裂，导致水解酶大量释放，造成神经元坏死。激活后的calpain还可引起线粒体渗透性转变（MTP），导致细胞死亡[10]。

以往一直认为calpain主要参与细胞坏死，但越来越多的证据表明它也在凋亡中也起着重要作用。Jordan等[11]研究发现钙蛋白酶抑制剂calpeptin及MDL28170可显著抑制培养的神经胶质母细胞瘤细胞及海马神经元的凋亡，说明calpain参与了神经元的凋亡的发生。以往的研究发现侧脑室注射钙蛋白酶抑制剂calpeptin可显著减少MCAO术后大鼠海马CA1区神经元的凋亡，进一步证实calpain参与了脑缺血后神经元凋亡[12]。calpain参与脑缺血后神经元凋亡的机制目前尚不清楚，本研究发现calpeptin可减少MCAO术后大鼠海马CA1区神经元caspase-3的表达，caspase-3是执行细胞凋亡的最重要的蛋白，因此推测calpeptin可能是通过抑制caspase-3的表达而抑制神经元凋亡。有研究发现calpain可切割pro-caspase-3和pro-caspase-9等，促进caspase-3的激活[13]。calpain可促进caspase-3的激活从而促进caspase-3介导的细胞凋亡[14]。Samantaray等[15]的研究发现：calpain抑制剂CX295可显著抑制大鼠单侧低氧缺血后caspase-3的表达，进一步研究表明pro-caspase-3可被calpain裂解，形成29 kDa的片段，该片断很容易被进一步的裂解而激活。本实验中，calpeptin抑制caspase-3的表达的具体机制不明，有待于进一步的研究。

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医学论文表与图的写作要求

一、制表的基本要求

1.重点突出，简单明了，主谓分明，层次清楚。

2.结构完整，有自明性，表的内容不要与文字、插图重复。

3.表中的量、单位、符号、缩略语等须与正文一致。

二、图应具有自明性，即只看图、图题和图例，不阅读正文，就可理解图意；内容不要与文字、表格重复；类型应与资料性质匹配。

1.线条图要求线条均匀、主辅线分明，并使数轴上刻度值的标法符合数学原则。

2.照片图要求有良好的清晰度和对比度，层次分明，反差适中，没有杂乱的背景。

3.图高度与宽度的比例一般掌握在5∶7左右。

4.图中的量、单位、符号、缩略语等须与正文一致。

Effect of Calpain Inhibitor in Reducing Neuron Apoptosis of Hippocampal CA1 Section of the Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion Model in Rats/

KUANG Zhong-shen，XU Hang，HUANG Zheng，et al.//Medical Innovation of China，2015，12（29）：015-018

Objective：To study the influence and mechanism of calpain inhibitor calpeptin in neuron apoptosis of hippocampal CA1 section in rats with focal cerebral ischemia-reperfusion.Method：128 health adult male SD rates were selected as the research animals.They were divided into the MACO group，the calpeptin group，the DMSO group and the sham group.The left middle cerebral artery（MCA） occlusion model was performed.2 hours after the left middle cerebral artery occlusion，recirculations of 6，12，24 hours and 48 hours were given to the rates.6，12，24 hours and 48 hours after the recirculations，the neurological functions of the rats were evaluated，immunohistochemistry was used to detect the expression of caspase-3 in hippocampal CA1 section and the neuronal apoptosis in hippocampal CA1 section was detected by the method of terminal deoxynucleotidyl transferase（TdT）-mediated dUTP nick end-labelling（TUNEL）.Result：The differences in the indexes between the MCAO group and the MACO group were not statistically significant （P＞0.05）.The scores of neurological functions and the expression of caspase-3 in the calpeptin group were lower than those in the MCAO group and the MACO group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.12，24 hours and 48 hours after the recirculations，the situations of neuronal apoptosis in the calpeptin group were better than those in the MCAO group and the MACO group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：Calpeptin can reduce the neuronal apoptosis of hippocampal CA1 section in rats with ischemia-reperfusion injury and the mechanism may be related to the inhibition of the expression of caspase-3.

Calpain； Ischemia-reperfusion injury； Apoptosis； Caspase-3

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.29.005

2015-07-03） （本文编辑：王利）

国家自然科学基金地区基金（81360203）

①石河子大学医学院第一附属医院 新疆 石河子 832008

匡重伸

First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Medical School of Shihezi University，Shihezi 832008，China