江虹锐，邵 勇，刘小玲，白 洋，米顺利，杨 莉

（1.广西医科大学公共卫生学院，广西 南宁 530021；2.广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004；3.广东百维生物科技有限公司，广东 化州 525100；4.百洋水产集团股份有限公司，广西 南宁 530007）

罗非鱼鱼皮胶原多肽对体外肠道肿瘤的影响

江虹锐1,2，邵 勇2，刘小玲2，白 洋3，米顺利4，杨 莉1

（1.广西医科大学公共卫生学院，广西 南宁 530021；2.广西大学轻工与食品工程学院，广西 南宁 530004；3.广东百维生物科技有限公司，广东 化州 525100；4.百洋水产集团股份有限公司，广西 南宁 530007）

目的：体外研究罗非鱼鱼皮胶原多肽对人结肠癌细胞系LoVo增殖能力的影响，并初步探讨其作用机理。方法：体外培养人结肠癌LoVo细胞，噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tertrazolium bromide，MTT）法检测罗非鱼鱼皮胶原多肽对细胞增殖的影响；荧光探针染色法观察细胞膜及核的变化；激光共聚焦显微镜观察细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）表达；比色法检测细胞线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ和Ⅲ的活性。结果：罗非鱼鱼皮胶原多肽对LoVo细胞的增殖具有一定的抑制作用，当质量浓度为100 mg/mL、作用48 h时，抑制率达到55.03%（P＜0.05）；与空白对照组相比，经胶原多肽作用后，LoVo细胞核浓缩，细胞膜出现不完整，细胞凋亡；且细胞内活性氧水平表达显著增加（P＜0.05），细胞内线粒体呼吸链复合物Ⅲ的活性显著降低（P＜0.05），但对线粒体呼吸链复合物Ⅰ的活性无影响。结论：罗非鱼鱼皮胶原多肽对人结肠癌细胞具有一定的增殖抑制作用，可能与抑制线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性，使胞内ROS水平增加，破坏细胞膜形态有关。

罗非鱼鱼皮；胶原多肽；肠道肿瘤；活性氧；线粒体呼吸链复合物

胶原多肽是胶原蛋白或明胶经蛋白酶、酸、碱等一定外部条件降解后得到的分子质量约为500～30 000 D的产物[1]。胶原多肽的来源较多，主要有猪皮、猪骨、牛皮、鱼皮、鱼鳞等，加工工艺分为酸水解[2]、碱水解、高温热解以及酶解[3]。李少华等[4]以新鲜猪皮为原料，利用木瓜蛋白酶在60 ℃、pH 5的条件下得到胶原多肽水解度为14.91%。戴丹琴等[5]利用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按酶活力比3∶1复合，得到的牛皮胶原蛋白的水解度可达 32.02%。周亮等[6]研究了以热水法和酶解法相结合制备鱼鳞胶原多肽，最终水解度达23.17%。由于不同的降解条件获得的胶原多肽氨基酸残基序列组成及空间结构各不相同，使得其具有不同的生理活性，如抗氧化[7]、抗菌[8]和免疫调节[9]等。王茵等[10]研究了经复合酶水解制备出的罗非鱼皮胶原多肽降血压作用，其中高剂量组血压下降30.37 mmHg，并得出鱼皮胶原多肽对原发性高血压大鼠的降血压效果显著，长期饲喂还有稳定血压的功效的结论。殷娟娟等[11]以酶解脱钙罗非鱼鳞为原料制得胶原多肽，并证明其具有明显的抗疲劳活性。到目前为止，关于鱼皮胶原多肽抗肿瘤作用的报道较为少见。

结肠癌是肠道肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一。结肠癌的发病与环境因素、生活和饮食习惯明显相关，随着我国现代化程度和生活水平的提高，国民的饮食结构发生很大变化，精细粮食和高蛋白高脂肪食物的摄入不断增加，结肠癌的发病率呈逐年上升趋势[12]。因此，研究和开发预防肠道肿瘤的功能性食品具有很好的现实意义。本研究探讨罗非鱼鱼皮胶原多肽在体外对人结肠癌细胞系LoVo的增殖影响及作用机理，为罗非鱼下脚料的利用、胶原多肽产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼鱼皮胶原多肽，广东百维生物科技有限公司提供，分子质量≤6 000 D。其主要制作工艺为：鱼皮→脱灰→热酸处理→酶解→脱色→膜过滤→浓缩→干燥→产品。结肠癌细胞系LoVo，购自北京协和细胞资源中心。

F12K培养基 美国Hyclone公司；小牛血清 四季青有限公司；噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyltertrazolium bromide，MTT）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、荧光探针Hochest33342、CM-DiI、线粒体超氧化物指示剂MitoSOX-RE 美国Life Technologies公司；线粒体分离试剂盒、线粒体呼吸链复合物Ⅰ/Ⅲ试剂盒 美国Genemed公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 北京索莱宝有限公司。

1.2 仪器与设备

Forma 3111 CO2培养箱 美国Thermo公司；Synergy H4 Hybrid全功能微孔板检测仪 美国Biotek公司；A1激光共聚焦显微镜 日本Nikon公司；FASscan流式细胞仪美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 LoVo细胞的培养

人结肠癌LoVo细胞在含有1%的青链霉素和20%新生胎牛血清的F12K培养液中培养，培养条件为37 ℃，5% CO2。当培养瓶中的细胞长满瓶底的60%～80%时，为对数生长期。用胰蛋白酶消化2～3 min后，在光学倒置显微镜下观察细胞突起、缩回，细胞间隙增大、近乎缩成圆形时，加入含有血清的F12K培养基终止消化，用吸管反复吹打，直至镜下观察形成单细胞悬液，取来血细胞计数板，计算细胞数量。按实验要求调细胞浓度。

1.3.2 胶原多肽样品的配制

称取一定量罗非鱼鱼皮胶原多肽，加入F12K培养基溶解配制成终质量浓度为1 g/mL的胶原多肽溶液，经0.22 μm滤膜过滤除菌，于4 ℃保存备用。实验前，用F12K培养基分别稀释成不同质量浓度梯度的胶原多肽溶液。以不含罗非鱼鱼皮胶原多肽的F12K培养基为对照样品。

1.3.3 细胞增殖抑制作用分析

将100 µL处于对数生长期的LoVo细胞按1×104cells/mL接种于96 孔细胞培养板中，37 ℃培养24 h后，弃去上清液，分别加入含有10、25、50、100、150、200 mg/mL罗非鱼鱼皮胶原多肽的F12K培养基，作用时间分别为24、48、72 h。作用后，每孔加入20 µL MTT溶液，继续培养4 h，弃上清。然后每孔加入100 µL DMSO，室温下低速振荡5 min，使细胞中产生的紫色结晶物（甲臜，formazan）充分溶解。全功能微孔板检测仪490 nm波长处测量各孔的光密度（OD）值。以F12K培养基作用组为空白对照。每组设3 个复孔。

1.3.4 细胞膜、核的形态观察

将LoVo细胞以1×104cells/mL的密度接种至35 mm玻底培养皿中，加入含20%小牛血清的F12K培养基于37 ℃培养24 h后，弃去上清。分别加入1 mL含100 mg/mL的罗非鱼鱼皮胶原多肽的F12K培养基作用48 h，弃去培养液。用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗，除去未贴壁的细胞和残留培养液，加入1 mL含有5 µL CM-DiI和1 µg Hochest 33342的F12K培养基，37 ℃孵育15 min后，PBS清洗两遍，于激光共聚焦显微镜观察LoVo细胞膜（λex/λem=553 nm/570 nm）和细胞核（λex/λem=350 nm/460 nm）形态。实验以F12K培养基作用组为空白对照。

1.3.5 流式细胞术检测LoVo细胞的凋亡

将LoVo细胞以1×104cells/mL的密度接种至6 孔细胞培养板，加入含20%小牛血清的F12K培养基于37 ℃培养培养24 h后，弃去上清。分别加入2 mL含100 mg/mL的罗非鱼鱼皮胶原多肽的F12K培养基作用48 h。胰酶消化细胞，1 000 r/min离心5 min收集细胞沉淀。按照AnnexinVFITC/PI试剂盒说明，对细胞进行染色，2 h内上流式细胞仪分析。实验以F12K培养基作用组为空白对照。

1.3.6 细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）表达观察

使用线粒体超氧化物指示剂MitoSOX-RED检测细胞中产生的ROS。将LoVo细胞以1×104cells/mL的密度接种至35 mm玻底培养皿中，加入20%小牛血清的F12K培养基培养24 h后，弃去上清。分别加入1 mL/皿含100 mg/mL的罗非鱼鱼皮胶原多肽的F12K培养基作用48 h，弃去培养液。用PBS除去未贴壁的细胞和残留培养液，将各皿中的细胞孵育在2 mL含有5 µmol/L MitoSOX-RED的HBSS/Ca/Mg溶液中30 min，37 ℃，磷酸盐缓冲液清洗两遍，在λex/λem=510 nm/580 nm处使用激光共聚焦显微镜观察LoVo细胞ROS表达。实验以F12K培养基作用组为空白对照。

1.3.7 细胞线粒体呼吸链复合酶的水平检测

将LoVo细胞以1×104cells/mL的密度接种至6 孔细胞培养板中，加入20%新生胎牛血清的F12K培养基培养24 h后，弃去上清，加入2 mL含100 mg/mL的罗非鱼鱼皮胶原多肽的F12K培养基作用48 h，弃去培养液。胰酶消化细胞，1 000 r/min离心10 min收集细胞沉淀。使用线粒体分离试剂盒提取LoVo细胞的线粒体，于－70 ℃保存。使用线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅲ试剂盒检测罗非鱼鱼皮胶原多肽对LoVo细胞作用后，细胞线粒体呼吸链复合酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-辅酶Q还原酶，reduced nicotinamide adenine dinucleotide-coenzyme Q reductase，NADH-Q reductase）和Ⅲ（辅酶Q-细胞色素c还原酶, reduced coenzyme Q-cytochrome c reductase，CoQH2-Cyt c reductase）的水平。

1.4 数据分析

实验数据统计及作图采用SPSS 13.0、Sigma Plot11.0软件，所有实验重复3 次，结果以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 罗非鱼鱼皮胶原多肽对肠道肿瘤细胞的增殖影响

由图1可知，罗非鱼鱼皮胶原多肽对LoVo细胞的抑制率随胶原多肽质量浓度的增加而增大，但随着作用时间的延长，其抑制率发生变化。作用24 h，胶原多肽达到最大抑制率的质量浓度为150 mg/mL，抑制率为（37.00±0.02）%；作用48 h，胶原多肽达到最大抑制率的质量浓度为200 mg/mL（抑制率（59.69±0.02）%）；作用72 h，胶原多肽达到最大抑制率的质量浓度为150 mg/mL，（抑制率为（46.15±0.03）%）。随着作用时间的延长，相同作用质量浓度达到细胞最佳抑制率的作用时间为48 h。100 mg/mL与150 mg/mL的胶原多肽在不同作用时间的抑制率较为接近。从抑制效果（抑制率超过50%）和适用性考虑，选择胶原多肽质量浓度为100 mg/mL、作用时间48 h（抑制率55.03%，P＜0.05）来研究胶原多肽对LoVo细胞增殖影响及作用机理。

图1 胶原多肽在不同质量浓度和时间对LoVo细胞的作用Fig.1 Effects of collagen peptides on the growth inhibition of LoVo cells at different concentrations and treatment times

2.2 罗非鱼鱼皮胶原多肽对肠道肿瘤细胞核、膜影响的形态学观察

相对于空白对照组，经100 mg/mL、48 h胶原多肽作用后LoVo细胞核（蓝色）出现核浓缩（图2A）；细胞膜（红色）着色不均匀，大多数细胞膜形态不完整（图2B）。从结果中推测，罗非鱼鱼皮胶原多肽作用后肠道肿瘤细胞核出现浓缩，且细胞膜受到破坏。

图2 胶原多肽对LoVo细胞膜和核形态的影响（160×）Fig.2 Membrane and nuclear morphology of LoVo cells treated by collagen peptides (160×)

2.3 罗非鱼鱼皮胶原多肽对肠道肿瘤细胞的凋亡作用

图3为LoVo细胞经FITC-AnnexinV和PI标记后，流式细胞仪分析细胞凋亡的实验结果。其中Q1域表示许可范围内的检测误差，Q2域表示坏死细胞和凋亡晚期细胞，Q3域表示正常细胞，Q4域表示早期凋亡细胞。除了细胞自身的发生程序性死亡外，与空白对照组（Q4=7.4%）相比，胶原多肽作用组对LoVo细胞有促凋亡作用（Q4=12.6%）。胶原多肽对LoVo细胞增殖活性的抑制可能与诱导凋亡有关。

图3 胶原多肽对LoVo细胞凋亡的诱导作用Fig.3 Effect of collagen peptides on the induction of apoptosis in LoVo cells

2.4 罗非鱼鱼皮胶原多肽对肠道肿瘤细胞ROS水平的影响

图4 胶原多肽对LoVo细胞中ROS表达的影响（160×）Fig.4 Expression of ROS in LoVo cells treated by collagen peptides (160×)

如图4所示，鲜艳的深红色为ROS，ROS大多数分布在细胞核，一部分表达在细胞间。空白对照组可见完整的细胞轮廓；与空白对照组相比，经100 mg/mL、48 h罗非鱼鱼皮胶原多肽作用的LoVo细胞数量减少，但ROS表达量显著增加。以视野中每104个LoVo细胞完全发荧光为100%计算LoVo细胞ROS相对荧光密度。空白对照组每104个LoVo细胞ROS相对荧光密度为（10.39±0.04）%；胶原多肽作用组相对荧光密度为（18.24±1.02）%（P＜0.05）。此外，通过ROS在LoVo细胞中的分布位置观察，发现经胶原多肽作用后的LoVo细胞内ROS几乎完全覆盖了细胞。该结果说明罗非鱼鱼皮胶原多肽对LoVo细胞增殖的抑制作用可能是通过增加细胞内的ROS水平造成活性氧损伤引起的。

2.5 罗非鱼鱼皮胶原多肽对肠道肿瘤细胞线粒体呼吸链复合物活性的影响

如图5A所示，与空白对照组中线粒体呼吸链复合物Ⅰ的活力（（6.85±0.92）μmol NADH/（min·mg））相比，罗非鱼鱼皮胶原多肽作用组对LoVo细胞的线粒体呼吸链复合物Ⅰ的活性有轻微的增强作用（（7.22±0.33） μmol NADH/（min·mg）），但差异不显著，无法判断罗非鱼鱼皮胶原多肽是否对LoVo细胞线粒体复合物Ⅰ有影响。如图5B所示，与空白对照组线粒体呼吸链复合物Ⅲ的活力（19.02±2.90）μmol CoQH2/（min·mg）相比，罗非鱼鱼皮胶原多肽作用组显著抑制了复合物Ⅲ的活力（（10.97±0.64） μmol CoQH2/（min·mg），P＜0.05）。从该结果中推测，罗非鱼鱼皮胶原多肽对肠道肿瘤细胞增殖抑制可能与其抑制细胞内线粒体呼吸链复合酶Ⅲ活性有关。

图5 胶原多肽对LoVo细胞线粒体呼吸链复合物活性的影响Fig.5 Effect of collagen peptides on the activity of mitochondrial complexes in LoVo cells

3 讨 论

罗非鱼是我国主要的淡水经济鱼种，随着我国水产品加工业的发展，特别是对鱼片加工，具有大量的鱼皮、鱼骨等下脚料资源。利用鱼皮、鱼骨等副产品提取胶原蛋白、胶原多肽等产品，在食品、化妆品和保健品领域有广阔的应用前景，大大提高了水产品加工副产物的产品附加值。因此，具有一定生物活性的胶原多肽对于功能性食品的开发可提供一定理论基础。

胶原蛋白经水解后可产生分子质量大小、氨基酸组成、空间结构不同的肽段，这些水解物具有多种生物活性，如抗高血压、抗菌、抗炎症和抗氧化等。在抗肿瘤方面，Monboisse等[13]研究发现从胶原蛋白中得到的一些分解产物对多种荷瘤鼠模型的肿瘤生长有很好的抑制作用；Popov等[14]发现经酶水解后的海参胶原蛋白能够延长腹水瘤小鼠的存活期；Pasco等[15]发现Ⅳ型胶原经水解后的部分肽段可控制黑色素瘤的浸润，其作用机制与抑制肿瘤细胞金属蛋白酶（metalloprotinases，MMP）的表达和活性有关。胶原蛋白的来源多来自于猪皮、猪骨、牛皮、鱼皮、鱼鳞、鼠尾等，关于鱼皮胶原蛋白及其水解产物在抗肿瘤方面的生物活性的报道较少。本研究中，MTT实验结果表示，与对照组相比，罗非鱼鱼皮胶原多肽对肠道肿瘤LoVo细胞的生长有显著的抑制作用；通过激光共聚焦扫描电镜观察发现，经胶原多肽作用后，LoVo细胞出现核浓缩，属于凋亡细胞的典型特征。细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）迁移至细胞外侧，可以利用细胞凋亡时细胞膜成分的改变来检测细胞的凋亡情况[16]。AnnexinV-PI染色法既可检测肿瘤的早期凋亡，又可区分凋亡与死亡细胞，本研究通过流式细胞仪、AnnexinV-PI染色法进一步检测胶原多肽对LoVo细胞凋亡的影响，结果发现，与对照组相比，罗非鱼鱼皮胶原多肽促进了LoVo细胞的早期凋亡。

细胞凋亡信号通路主要有两种：一种是死亡受体途径（外源性途径），另一种是线粒体途径（内源性途径）。其中，凋亡的线粒体途径包括线粒体膜通透化、细胞色素c的释放、电子传递的改变、细胞ROS的改变和相关信号蛋白和信号因子的表达变化[17]，继而导致细胞核浓缩、细胞膜内侧PS外翻、细胞膜泡状化。来源于线粒体的ROS水平对肿瘤发生、发展的各个阶段对肿瘤的存活和凋亡有重要影响[18]。肿瘤细胞中ROS的表达高于正常细胞[19]，且肿瘤细胞更容易受到氧化应激的伤害。低剂量的ROS会促进细胞生长[20]，而增加细胞内ROS水平可诱导细胞凋亡[21]。有研究表明罗非鱼胶原蛋白经过胃肠道消化酶水解后，其1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力增加，表现出较好的抗氧化活性[22]。目前，胶原多肽的抗氧化活性大多基于体外的化学分析检测，其对肿瘤细胞内ROS表达的抗氧化作用，还未见报道。本研究的结果表明，与对照组相比，经过罗非鱼皮胶原多肽作用后的LoVo细胞内ROS水平表达显著增强（P＜0.05），其对LoVo细胞的凋亡作用可能与ROS增加有关。为了寻找胶原多肽促进LoVo细胞内ROS水平升高的原因，本研究进一步检测了细胞线粒体呼吸链复合物Ⅰ和Ⅲ的活性。在肿瘤的生长过程中，常伴随着细胞线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突变的发生。而mtDNA突变会导致呼吸链复合物Ⅰ或Ⅲ缺乏，使呼吸链中途的“电子漏”将氧直接接受单电子生成ROS[23]。结果发现，罗非鱼鱼皮胶原多肽显著的抑制了复合物Ⅲ的活性，但对复合物Ⅰ的活性作用效果不明显。结果提示，罗非鱼鱼皮胶原多肽诱导LoVo细胞ROS表达增加的原因可能与抑制线粒体复合物Ⅲ活性有关。此外，由于细胞膜、线粒体膜、内质网膜等生物膜均由磷脂双分子层及膜蛋白构成，对ROS敏感，大量的ROS可损害细胞膜脂质，线粒体内膜[24]。本研究中，罗非鱼鱼皮胶原多肽经作用后的LoVo细胞内ROS的水平显著增强（P＜0.05），可能是造成细胞膜着色不均一、结构破坏的原因。罗非鱼鱼皮胶原多肽对LoVo细胞凋亡作用机制、以及对肿瘤细胞的生长抑制是否与其抗氧化活性有关，有待于进一步研究。

4 结 论

本实验通过体外实验初步探究了罗非鱼胶原多肽对肠道肿瘤的抑制机制。结果表明，罗非鱼鱼皮胶原多肽对结肠癌细胞LoVo的增殖具有抑制能力，从形态学观察发现，细胞核浓缩、细胞膜受到破坏；从流式细胞术观察发现，胶原多肽作用后对结肠癌细胞具有促凋亡作用；此外，经胶原多肽作用后，细胞内ROS表达显著增强（P＜0.05），这可能与其抑制细胞线粒体呼吸链复合物Ⅲ活性有关。胶原多肽对LoVo细胞抑制作用机理有待进一步研究。

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Effects of Collagen Peptides from Tilapia Skin on Colon Carcinoma in Vitro

JIANG Hongrui1,2, SHAO Yong2, LIU Xiaoling2, BAI Yang3, MI Shunli4, YANG Li1
(1. Public Health of Guangxi Medicine University, Nanning 530021, China; 2. College of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China; 3. Guangdong Baiwei Biological Technology Co. Ltd., Huazhou 525100, China; 4. Baiyang Aquatic Group, Inc., Nanning 530007, China)

Objective: To investigate the effects of collagen peptides from tilapia skin on the proliferation ability of human colon carcinoma cell line LoVo in vitro and its possible mechanism. Methods: The inhibitory effects of collagen peptides from tilapia on the proliferation of LoVo cells were observed by MTT assay. Fluorescent staining method was used to analyze the effect on cell membrane and nucleus. Laser confocal microscopy was used to examine reactive oxygen species (ROS) expression in LoVo cells. The activities of mitochondrial respiration chain complex I and III were analyzed by colorimetry. Results: Collagen peptides from tilapia skin showed certain inhibitory effect on the proliferation of LoVo cells. After being treated by 100 mg/mL of collagen peptides for 48 h, the growth inhibitory effect rate reached 55.03% (P ＜ 0.05). Compared with the control group, the nucleus of LoVo cells was shrunk and cell membrane was destructed after being treated by collagen peptides. Meanwhile, the ROS level was significantly increased (P ＜ 0.05). Collagen peptides significantly inhibited the activity of complex III. Conclusion: Collagen peptides from tilapia skin have inhibitory effects on the proliferation of human colon carcinoma cells, which is probably associated with the inhibited activity of mitochondrial respiration chain complex III in LoVo cells, promoting ROS expression and destructing the cell membrane in LoVo cells.

tilapia skin; collagen peptides; colon carcinoma; reactive oxygen species (ROS); mitochondrial respiratory chain complex

TS254.6

A

1002-6630（2015）21-0196-05

10.7506/spkx1002-6630-201521037

2015-01-06

国家自然科学基金青年科学基金项目（31201349）；茂名市科技计划项目（2012A01005）；

广西医科大学博士后科研资助项目（20121018）

江虹锐（1984－），女，副教授，博士，研究方向为食品营养与安全。E-mail：jianghr1984@163.com