李 斌

（河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003）

Alcalase酶解狼山鸡肉蛋白规律

李 斌

（河南科技学院食品学院，河南 新乡 453003）

以狼山鸡为实验材料，分析Alcalase酶解鸡肉蛋白规律。结果表明：酶解鸡肉蛋白的最适酶解温度为45 ℃、酶添加量为2.0 U/g、酶解时间为4 h；酶解过程中肌浆蛋白和肌原纤维蛋白有较多的氨基酸释放，并且可溶性氮也有大量的累积，酶解产物的分子质量主要集中在30～50 kD之间；在酶解产物中含量最高的氨基酸分别为天冬氨酸和谷氨酸，并且在酶解产物中亲水性氨基酸（hydrophilic amino acid，HLAA）与疏水性氨基酸（hydrophobic amino acid，HBAA）比值在1.41～1.52之间；通过对酶解产物游离氨基酸营养价值的分析，在不同酶解时间的酶解产物中含有丰富的必需氨基酸，该必需氨基酸指数与联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（Food Agriculture Organization/World Health Organization，FAO/WHO）推荐的成人理想氨基酸模式相类似。

狼山鸡；碱性蛋白酶；蛋白质水解；游离氨基酸

蛋白质酶解是指蛋白质在酶的作用下降解成肽类或更小分子质量的氨基酸的过程[1-2]，是改造蛋白质、提高蛋白质价值的最有效途径之一，具有酶解条件温和、产物安全性高、营养价值高、易消化、易与其他风味物质搭配等优点，已成为当今蛋白质领域最大的发展方向之一[3-5]。肌浆蛋白、肌原纤维蛋白是构成鸡肉蛋白的主要成分，任何蛋白酶的酶解规律都体现着鸡肉蛋白的水解规律[6-7]，对于酶解蛋白的规律及原理的研究是合理利用酶解产物的前提[8-9]。蛋白质的分解程度可由蛋白质水解指数反映，为决定蛋白酶解产物的具体应用领域、确定其营养价值，有必要对酶解产物中的一些诸如氮的存在形式、氨基酸种类等宏观指标进行宏观的分析，以确定酶解产物的存在形式。对于Alcalase，目前已经有很多文献对其做出报道[10-11]。研究表明，在水解动物蛋白（如鱼蛋白、酪蛋白、乳清蛋白等）无论是从技术和经济及原料来源角度而言，Alcalase是最高效酶之一，其中最广泛的应用主要是在鱼肉蛋白中[12-14]。此外，Alcalase因其作用位点的多样性而被广泛应用到酶解动物蛋白中[15]。目前，Alcalase对肌肉蛋白水解的过程及产物的研究较少。因此，本实验以Alcalase为鸡肉原料水解酶，通过研究酶解过程中可溶性氮、氨基酸和肽基氮的释放模式，以深入研究鸡肉蛋白的酶解机理，理解鸡肉蛋白酶解产物中营养价值的释放规律。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

狼山鸡（鸡龄365 d）由南通市双和食品有限公司提供，取同一批鸡胸肉剔除肌膜，切碎混匀，－20 ℃保存备用。

Alcalase 2.4 L（酶活力＞200×104U/g） 丹麦诺维信公司；乙二胺四乙酸（elhylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、Tris、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考马斯亮蓝、巯基乙醇、过硫酸胺美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

Allegra 64R型高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；2300型KjeltecTM自动凯氏定氮仪、KDN-04消化炉 丹麦Foss分析仪器公司；SPX-250C型恒温恒湿箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；FR-980生物电泳图象分析系统 上海复日科技有限公司；602S稳压稳流电泳仪 北京六一仪器厂；JA2203N电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；UV-2450紫外分光光度计 日本岛津公司；氨基酸自动分析仪日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 Alcalase酶解鸡肉蛋白条件的确定

酶添加量：称取鸡胸肉10 g按照酶添加量分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 U/g加酶溶液后（肉液比为1∶1.5，m/V）置于45 ℃水浴中，酶解4 h后分别测定产物中蛋白质水解指数。

酶解温度：称取鸡胸肉10 g加酶溶液后（1.5 U/g、肉液比1∶1.5）分别置于25、30、35、40、45、50、55 ℃水浴中反应，酶解4 h后分别测定产物中蛋白质水解指数。

酶解时间：称取鸡胸肉10 g加酶溶液后（1.5 U/g、肉液比1∶1.5）置于45 ℃水浴中分别酶解0、2、4、6、8、10 h后分别测定产物中蛋白质水解指数。

1.3.2 Alcalase酶解鸡肉蛋白规律研究

蛋白组分分解变化：分别将提取的肌浆蛋白、肌原纤维蛋白各5 g，加酶溶液后（1.5 U/g、肉液比1∶1.5）置于45 ℃水浴中分别酶解1、2、3、4、5、6 h，分别测定蛋白质水解指数。

氮的存在形式：分别将提取的肌浆蛋白、肌原纤维蛋白、基质蛋白各5 g，加酶溶液后（1.5 U/g、肉液比1∶1.5）置于45 ℃水浴中分别酶解1、2、3、4、5、6 h，分别测定酶解液中氨基态氮、可溶性氮和肽基氮的含量。

酶解产物分子质量分布：采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析酶解1、2、3、4、5、6 h后蛋白质分子质量。

氨基酸释放规律：称取鸡胸肉5 g加酶溶液后（1.5 U/g、肉液比1∶1.5）置于45 ℃水浴中分别酶解0、1、2、3、4 h后分别用氨基酸自动分析仪测定酶解产物中的氨基酸组成。

1.3.3 指标分析

1.3.3.1 肌浆蛋白提取

称取2 g剪碎肉样，加入20 mL 0.02 mol/L pH 6.5的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS），高速分散器匀浆（6 000 r/min，3 min），冷冻离心（10 000×g，4 ℃，20 min），吸取上清液即为肌浆蛋白[16]。

1.3.3.2 肌原纤维蛋白提取

上述离心沉淀物重新悬浮于0.03 mol/L pH 6.5的PBS中，在高速分散器中匀浆（6 000 r/min，4 min），然后离心（10 000×g，4 ℃，20 min），去除上清液，重复以上操作3 次，目的是为了除去肌肉中的内源蛋白酶，最终沉淀再次悬浮于8 mL 0.1 mol/L pH 6.5的PBS中，另加入KI和NaN3使最终浓度和质量分数分别为0.7 mol/L和0.02%，悬浮液在高速分散器中匀浆（7 000 r/min，3 min），然后离心（10 000×g，4 ℃，20 min），吸取上清即为肌原纤维蛋白[16]。

1.3.3.3 蛋白质水解指数测定[17]

总氮（total nitrogen，TN）含量测定：样品解冻绞碎后，称取1 g（精确到0.001 g）于消化管中，加12 mL浓硫酸及1 片消化片于消化管中，420 ℃消化1.5 h，冷却后用自动凯氏定氮仪测定TN含量。

非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）含量测定：样品解冻绞碎后，取5 g（精确到0.001 g）加入质量分数10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）25 mL，高速分散器匀浆3 次（5 000 r/min，20 s/次），4 ℃放置过夜，冷冻离心（4 ℃，5 000×g，5 min），过滤，取滤液于消化管中，加5 mL浓硫酸于220 ℃烘水1 h，再加硫酸7 mL，420 ℃消化1.5 h，冷却后用自动凯氏定氮仪测定NPN。蛋白质水解指数（proteolysis index，PI）按式（1）计算。

1.3.3.4 不同存在形式氮含量测定

可溶性氮含量测定：采用微量凯氏定氮法测定水解产物上清液中氮的含量，以占总氮含量百分比表示。

氨基态氮含量测定：水解产物中氨基态氮含量采用甲醛电位滴定法测定，以占总氮含量百分比表示[18]。

肽基氮含量测定：水解产物中肽基氮的含量=可溶性氮含量－氨基态氮含量。

1.3.3.5 蛋白质分子质量测定

利用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，必要时稀释一定倍数。SDS-PAGE[16]测定分子质量分布：将酶解后的蛋白产物配制成蛋白样品并与标准分子质量蛋白进行SDS-PAGE，10%分离胶，5%浓缩胶，用考马斯亮蓝G-250染色，Quantity-One分析蛋白质分子质量。

1.3.3.6 游离氨基酸总量（total free amino acid，FAA）测定

参考Virgili等[19]的方法，略作修改：准确称取样品6.00 g，加入60 mL 0.2 mol/L PBS（pH 6.5），匀浆（6 000 r/min，3 min），离心（10 000×g，4 ℃，20 min），取上清液0.5 mL，用质量分数为3%水杨酸溶液调节pH值至2.0，加入0.25 mL双蒸水，离心（15 000×g，4 ℃，20 min），取上清液0.5 mL，使用0.02 mol/L盐酸稀释5～10 倍，用氨基酸自动分析仪检测。检测条件：洗脱液为柠檬酸缓冲液（pH 3.3～4.9），显色液为茚三酮-乙二醇甲醚-乙酸钠缓冲液（2∶75∶25，V/V），除羟脯氨酸在440 nm波长处检测外，其余氨基酸均在570 nm波长处检测。

1.3.3.7 氨基酸评分（amino acid score，AAS）计算

根据Liaset等[20]的方法确定酶解产物的营养价值，具体为：采用联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（Food Agriculture Organization/World Health Organization，FAO/WHO）推荐的蛋白质模式。

1.4 数据处理

用Microsoft Excel进行数据整理，采用Origin 8.0进行作图分析。不同平均值之间用SAS 8.2（SAS Institute Inc, Cary, North Carolina, USA）统计软件的GLM程序（general linear model procedure）中的邓肯氏多重比较法（Duncan’s multiple range test）进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 Alcalase酶解鸡肉蛋白条件分析

图1 不同酶解条件对鸡肉蛋白质水解的影响Fig.1 Effects of different enzymatic hydrolysis conditions on PI

由图1a可知，随着酶解温度的升高蛋白质水解指数呈现先上升后下降的趋势。Alcalase作为一种耐高温酶，在一定的底物和Alcalase酶添加量下，鸡肉蛋白质水解指数随着温度的升高呈上升趋势，当温度在45 ℃左右时酶解蛋白达到30%，当酶解温度高于45 ℃时，蛋白质的分解逐渐降低，该趋势与Alcalase酶活性的趋势大致相同[21]。

由图1b可知，随着酶添加量的增加蛋白水解指数呈上升趋势，当酶添加量增加到2.0 U/g时，趋势略有降低，但蛋白质水解指数也有显著增长（P= 0.013＜0.05），主要是因为Alcalase底物专一性较低，随着酶添加量的增加，大量的底物被分解。这与成堃等[22]对碱性蛋白酶的酶学性质研究基本相同，当酶添加量增加到2 U/g左右时，蛋白水解指数大约为32%。另外，由图1c可知，随着酶解时间的延长，鸡肉蛋白质逐渐被分解，表现为蛋白质水解指数的增大，非蛋白氮的逐渐积累。当酶解时间在4 h左右后，蛋白质水解指数无显著的增加趋势（P＝0.137＞0.05），此时蛋白水解指数大约为30%，主要原因是Alcalase酶的热稳定性在4 h后降低，这与赵谋明等[23]对不同酶解鸡肉蛋白随酶解时间变化的规律一致。

2.2 Alcalase酶解鸡肉蛋白过程分析

2.2.1 酶解产物分解变化

图2 肌浆蛋白酶解产物的氮存在形式Fig.2 Existing forms of nitrogen in sarcoplasmic protein during enzymatic hydrolysis

由图2可知，随着酶解时间的延长，肌浆蛋白中3 种氮的存在形式都有不同程度的累积。对于可溶性氮，在酶解4 h前有显著增加趋势（P＜0.05），在酶解时间大于4 h后，该趋势趋于平缓；氨基态氮在整个过程中都有累积；而肽基氮在4 h后出现了一定程度的降低。酶解4 h，部分肌浆蛋白被分解，3 种氮的存在形式都在累积；在4 h后，酶的热稳定性降低或构象的改变使酶活力降低，部分肽类物质在该温度内继续分解，表现为肽基氮的含量减少，氨基态氮的积累。

图3 肌原纤维蛋白酶解产物的氮存在形式Fig.3 Existing forms of nitrogen in myofibrillar protein during enzymatic hydrolysis

由图3可知，肌原纤维蛋白的酶解产物中可溶性氮、氨基态氮、肽基氮的含量都在上升。在1～4 h内，产物中3 种氮都保持较快的增长速率，尤其是可溶性氮，在1～4 h中由22.5%增长到50%，在酶解4 h后，也有部分增长，表明Alcalase对肌原纤维蛋白有较大的酶解作用；肽基氮在酶解4 h后含量趋于平缓，占总氮的20%左右；氨基态氮的含量一直累积，在整个过程中有显著增加趋势（P＜0.05），在酶解6 h后达到30%。

2.2.2 酶解鸡肉蛋白过程电泳分析

图4 不同酶解过程中酶解产物的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE profiles of hydrolyzed products after different hydrolysis times

由图4可知，随着酶解过程的进行，酶解产物中高分子质量的蛋白质被降解，低分子质量蛋白不断生成。在酶解1 h后，95 kD所有的蛋白条带消失，40～90 kD以及35 kD附近出现两条较低分子质量的条带，随着酶解过程的进行，伴随着49 kD条带的加深及35 kD条带的出现，90 kD附近条带消失，在酶解4 h后，并无条带消失和新条带的出现，在酶解6 h时，35 kD左右处蛋白累积，出现这现象的原因可能是温度导致蛋白质的水解。表明Alcalase能够降解狼山鸡肉蛋白，可以用于狼山鸡肉的酶解开发。

2.2.3 不同酶解过程中氨基酸释放规律的研究

Alcalase酶解狼山鸡肉蛋白过程中酶解产物氨基酸组成见表1。从整个酶解过程来看，随着酶解过程的进行，氨基酸总量呈明显的上升趋势，并且产物中各种氨基酸的含量也有明显的增加，氨基酸总量在酶解4 h后由1 095.50 mg/100 mL增加到1 870.33 mg/100 mL，约增加了1.71 倍。从各时期不同氨基酸占氨基酸总量来看，在酶解过程中占总量最多的是谷氨酸、组氨酸和天冬氨酸，这3 种成分总量占氨基酸总量的35%左右，这正是狼山鸡味道鲜美的主要原因。另外，整个酶解过程中在不同的时间段内，同一氨基酸的释放速率也有所差异，可能的原因是与酶作用基团的特异性以及水解的随机性有关。

表1 狼山鸡肉蛋白酶解过程中产物的氨基酸组成分析Table 1 Free amino acid composition of chicken protein hydrolysates during enzymatic hydrolysis mg/100 mL

另外，整个酶解过程中游离氨基酸总量一直呈上升趋势，从182.82 mg/100 mL上升到506.41 mg/100 mL，增长了约2.77 倍。在未酶解组中（0 h），游离氨基酸含量最多的是精氨酸、缬氨酸和赖氨酸，分别占总量的25.0%、12.0%、12.5%。根据文献报道，Alcalase酶解鸡肉蛋白的主要位点为丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸，在酶解过程中此类氨基酸有明显增长。在酶解过程中同样有较多累计的游离氨基酸还有丝氨酸、谷氨酸和精氨酸，可能的原因是此类氨基酸为亲水性氨基酸，在酶解过程中容易受到酶的作用从肽链中释放。其中，在整个酶解过程中，增加最少的是半胱氨酸，其余氨基酸在整个酶解过程中都有较平稳的增长，在酶解3～4 h过程中增加量明显的减少，尤其是精氨酸和酪氨酸在此过程中出现了较小幅度的降低。主要是因为在实验条件下温度和pH值也有利于蛋白的合成，正是由于体系中底物浓度的升高造成合成类蛋白反应的速率加快；另外，减少的氨基酸的另一个去向可能是参与了美拉德反应，并产生大分子物质并在离心过滤时被去掉。

2.2.4 Alcalase酶解鸡肉蛋白产物价值评定

2.2.4.1 亲水性氨基酸/疏水性氨基酸（hydrophilic amino acid/hydrophobic amino acid，HLAA/HBAA）变化

表2 狼山鸡肉蛋白酶解过程中HLAA、HBAA含量分析Table 2 Contents of hydrophilic and hydrophobic amino acids released during enzymatic hydrolysis mg/100 mL

由表2可知，无论是亲水氨基酸还是疏水氨基酸总量都有增加，在不同酶解时间产物中的HLAA/HBAA在1.41～1.52之间，差异较小，可能原因是Alcalase的酶作用特点决定了酶解产物中HLAA/HBAA值的波动。

2.2.4.2 营养价值评定

表3 狼山鸡肉蛋白酶解产物营养评价Table 3 Nutritional evaluation of chicken meat hydrolysates

在酶解产物中甜味和鲜味氨基酸的含量变化对酶解鸡肉蛋白产物的营养有着重要的作用。由表3可知，在酶解产物中各酶解时间都含有丰富的必需氨基酸，各必需氨基酸指数都与FAO/WHO推荐的成人理想氨基酸模式相接近，并且各时间段的氨基酸评分均高于水溶性提取物。在鸡肉蛋白的酶解过程中必需氨基酸指数以及氨基酸分成不规则的变化趋势，因此，可以通过对酶解鸡肉蛋白的不同程度调节其营养价值。由于酶解作用的特点可以看出在不同的酶解过程中，0～3 h第一限制性氨基酸主要是含硫氨基酸，随着酶解时间的延长，第一限制性氨基酸变为苏氨酸，因此可以通过不同的酶解时间调节酶解产物的营养价值。

3 结 论

通过对狼山鸡鸡胸肉蛋白酶解条件的研究表明，酶解鸡肉蛋白的最适酶解温度为45 ℃、酶添加量为2.0 U/g、酶解时间为4 h。在酶解过程中鸡肉蛋白的组分氮的存在形式表明，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白有较多的氨基酸释放，并且可溶性氮也有大量的累积，对于基质蛋白各种氮累积量较少。在酶解过程中，分子质量大于90 kD的蛋白质被大量分解，酶解产物中分子质量小于35 kD的的蛋白不断累积。酶解产物的分子质量主要集中在30～50 kD之间。酶解鸡肉蛋白产物的各种氨基酸呈现不规则的变化趋势，丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等氨基酸在酶解后期有下降的趋势。在酶解产物中含量最高的氨基酸分别为天冬氨酸和谷氨酸。在酶解产物中亲水性氨基酸（HLAA）与疏水性氨基酸（HBAA）比值在1.41～1.52之间。通过对酶解产物游离氨基酸的营养价值的分析，在不同酶解时间的酶解产物中含有丰富的必需氨基酸，该必需氨基酸指数与FAO/WHO推荐的成人理想氨基酸模式相类似。

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Regularity and Mechanism of Enzymatic Hydrolysis of Muscle Proteins from Langshan Chicken by Alcalase

LI Bin
(College of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

In this study, alcalase was applied to hydrolyze Langshan chicken breast meat. The results showed that the optimum temperature, enzyme dosage and hydrolysis time for enzymatic hydrolysis of chicken protein were 45 ℃, 2.0 U/g, and 4 h, respectively. Many amino acids derived from sarcoplasmic and myofibrillar proteins were released during enzymatic hydrolysis and soluble nitrogen was also accumulated in a large quantity. The molecular weights of peptides in the hydrolysate were mainly distributed in the range of 30-50 kD. Aspartic acid and glutamic acid were the most abundant amino acids in the hydrolysate with a ratio of hydrophilic amino acids (HLAA) to hydrophobic amino acids (HBAA) ranging from 1.41 to 1.52. The analysis of the nutritional value of free amino acids indicated the presence of abundant quantities of essential amino acids at different hydrolysis time and an essential amino acid index similar to the FAO/WHO recommended value from the ideal amino acid pattern for adults.

Langshan chicken; alcalase; proteolysis; amino acids

TS251.55

A

1002-6630（2015）21-0156-06

10.7506/spkx1002-6630-201521030

2015-01-15

河南省高校科技创新团队支持计划资助项目（13IRTSTHN006）

李斌（1981—），男，讲师，硕士，研究方向为畜产品加工与质量控制。E-mail：later@126.com