李 利，孔 丽，张 宁，赵伟超，肖亦农，李炳学,*，韩晓日

（1.沈阳农业大学土地与环境学院，土肥资源高效利用国家工程实验室，辽宁 沈阳 110866；2.沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866）

耐酸耐胆盐乳酸菌的鉴定及筛选

李 利1，孔 丽2，张 宁2，赵伟超2，肖亦农1，李炳学1,*，韩晓日1

（1.沈阳农业大学土地与环境学院，土肥资源高效利用国家工程实验室，辽宁 沈阳 110866；2.沈阳农业大学生物科学技术学院，辽宁 沈阳 110866）

从自然发酵的酸奶中分离出2 株细菌，经16S rDNA分子鉴定为Lactobacillus plantarum SN1和Lactobacillus rhamnosus SN6，并对其生长曲线、产酸速率、耐酸耐胆盐能力进行了研究。L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6在2 h后进入对数期，16 h后达到稳定期，其OD600nm值分别为8.47、7.43。L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6的产酸速率较快，ph值在8 h后就降到了4.2以下，48 h后降到3.3左右。L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6在ph 4的培养基培养16 h后，其相对OD600nm值分别为49.29%、47.14%，具有较强的耐酸能力。L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6在0.3 g/L胆盐质量浓度下培养16 h后，相对OD600nm值分别为57.7%、69.48%；在0.6 g/L胆盐质量浓度下的相对OD600nm值分别为48.22%、29.56%，具有较强的耐胆盐能力。结果表明：L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6是生长性能好、产酸能力强、耐酸耐胆盐的益生菌株。

乳酸菌；耐酸耐胆盐；16S rDNA序列分析

乳酸菌是发酵葡萄糖，主要代谢终产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称[1]，包括乳杆菌属、魏斯氏菌属、肉杆菌属、链球菌属、肠球菌属、乳球菌属、漫游球菌属、明串球菌属、酒球菌属、四联球菌属等[2]，具有促进营养物质消化和吸收、降低血清胆固醇、调节肠道菌群平衡、激活机体免疫系统、改善食品风味和预防癌症等生理功能[3]，在工业、农业、食品及医疗保健等与人类密切相关的领域中有很高的应用价值[4]。自然界中乳酸菌种类很多，分布极广，在乳制品、肉制品、水果、蔬菜及植物制品上都有发现，有些种类甚至存在于人体的口腔、胃肠中[5]。

分离自开菲尔粒的植物乳杆菌Lp27[6]，发酵酸肉的消化乳杆菌SR10[7]，奶豆腐的屎肠球菌M1-1、植物乳杆菌M1-2、乳酸片球菌M1-3[8]，人肠道的屎肠球菌、食窦魏斯氏菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌[9]、鼠李糖乳杆菌Lr10[10]，均具有降胆固醇的益生作用。分离自发酵食品和粪便的植物乳杆菌CCFM8661和干酪乳杆菌CCFM1566[11]，奶豆腐的鼠李糖乳杆菌M6-1[8]具有抗氧化能力。从风干香肠中分离的明串珠菌既有去除胆固醇能力、又有抗氧化能力[12]。分离自开菲尔粒的乳酸乳球菌乳亚种hUCM 201[13]，人肠道的植物乳杆菌L2[14]对肠道细胞表现出了良好的黏附性。从酸菜中分离的植物乳杆菌[15]，传统乳制品、仔猪粪便及鸡肠道分离的短乳杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌[16]对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等有害菌株，均有明显的抑菌效果。分离自奶酪的植物乳杆菌具有调节肠道菌群的功能[17]，分离自传统乳制品中的保加利亚乳杆菌LJJ自溶活性较强[18]。

乳酸菌在人体内发挥益生作用的前提是其可在人体肠道中存活并定殖，而乳酸菌能否在人体内存活定殖主要与其耐酸耐胆盐能力有关[19]。因此，耐酸耐胆盐能力是筛选益生性乳酸菌的一个重要指标[20]。本实验从自然发酵的酸奶中分离出2 株乳酸菌，并对其生长曲线、产酸速率、耐酸耐胆盐能力进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料、培养基与试剂

酸奶是将鲜牛奶封闭于灭菌容器内，经37 ℃自然发酵1 d制成。Lactobacillus plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、Lactobacillus brevis CGMCC 1.558、Lactobacillus acidophilus CGMCC 1.1878、Lactobacillus casei CGMCC 1.2435、Lactobacillus pentosus CGMCC 1.2439、Lactobacillus rhamnosus CGMCC 1.2466购自中国普通微生物保藏管理中心。

MRS液体培养基（g/L）：蛋白胨10.0、牛肉膏10.0、酵母粉5.0、葡萄糖20.0、柠檬酸二钠2.0、吐温-80 1.0、K2hPO42.0、乙酸钠5.0、(Nh4)2SO41.63、MgSO40.58、MnSO40.25，ph值为6.5，115 ℃灭菌30 min。

DNA 2000 Marker 宝生物工程（大连）有限公司；2×Taq MasterMix 北京康为世纪生物科技有限公司；GoodView核酸染料 北京赛百盛基因技术有限公司。其他试剂均为进口或国产分析纯产品。

1.2 仪器与设备

TC-412型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪 英国Techne公司；Bio-Rad universal hoodⅡ型凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；Lambda Bio35 紫外-可见分光光度计 美国Perkin Elme公司；GNP-9080型电热恒温培养箱 上海精宏实验设备公司；ph计 美国Orion公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分离及初步鉴定

称取5 g自制酸奶样品，用45 mL无菌水均质，然后做10 倍系列稀释，取10-4、10-5、10-63 个稀释度，各稀释度取0.1 mL液体分别涂布于固体MRS培养基平板上，37 ℃厌氧培养48～72 h。根据形态特征挑选典型菌落，反复划线获得纯菌株，进行革兰氏染色镜检和过氧化氢酶实验。

1.3.2 乳酸菌16S rDNA分子鉴定

1.3.2.1 引物的设计与合成

16S rDNA通用引物：7F：5’-CAGAGTTT GATCCTGGCT-3’；1540R：5’-AGGAGGTGA TCCAGCCGCA-3’。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.2.2 总DNA的提取[21]

取过夜培养的菌液1 mL置于1.5 mL EP管中，4 000 r/min离心5 min 后，弃上清收获菌体。在沉淀物中加入100 μL裂解液（100 mmol/L Tris、30 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、0.5%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）），沸水浴15 min后，加入100 μL的2.5 mol/L醋酸钾后，置于冰上30 min。再加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1，V/V）剧烈振荡后，12 000 r/min离心10 min，取上清加入等体积的冷的异丙醇，－20 ℃静置15 min；13 000 r/min离心15 min；用100 μL 体积分数70%的乙醇洗涤沉淀，13 000 r/min离心5 min，用100 μL 无水乙醇再次洗涤沉淀，将沉淀置于真空干燥器中抽干，加入50 μL ddH2O溶解，即为DNA。将提取的DNA于－20 ℃条件下保存备用。

1.3.2.3 PCR 扩增

反应体系为DNA模板1.5 µL；2×Taq MasterMix 12.5 µL；10 µmol/L 7F、1540R上下游引物各0.5 µL；加无菌水至总体积为25 µL。PCR条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，共35 个循环；第35个循环72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。按照以上条件设定程序，使用PCR仪进行PCR扩增。

1.3.2.4 PCR扩增产物的凝胶电泳

配制1%的琼脂糖凝胶，以5∶1（V/V）的比例加入PCR产物和6×Loading buffer，在100 V电压条件下电泳30 min，利用紫外凝胶成像系统进行观察与分析。最后，将PCR产物送到生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将测序结果在GenBank中进行BLAST分析，构建系统发育树。

1.3.3 乳酸菌生物学性质研究

1.3.3.1 生长曲线测定

将活化的菌株，按3%接种量接种于MRS 液体培养基中，37 ℃厌氧培养36 h，每隔2 h取样，在600 nm波长处测定样品的光密度（OD）值，绘制生长曲线图。

1.3.3.2 产酸性实验

将活化的菌株，按3%接种量接种于MRS 液体培养基中，37 ℃厌氧培养30 h，每隔2 h取样测ph值。

1.3.3.3 耐酸性实验

将活化的菌株，按3%接种量接种于ph值分别为2.0、4.0、6.0、6.5和7.0的MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养16 h，测各组菌液的OD600nm值。

1.3.3.4 耐胆盐实验

将活化后的菌株，按3%接种量接种于胆盐质量浓度分别为0、0.3、0.6 g/L的MRS液体培养基中，37 ℃厌氧培养16 h，测各组菌液的OD600nm值。

2 结果与分析

2.1 菌落形态及细胞形态的初步鉴定

从酸奶中共分离出2 株革兰氏染色阳性、过氧化氢酶阴性的杆菌，分别命名为SN1、SN6。菌落形态为乳白色或白色、表面光滑、边缘整齐、大小不一的圆形菌落。细胞形态为短杆状，一般呈单个、成对或链状排列。

2.2 乳酸菌16S rDNA基因序列分析

图1 分离株16S rDNA基因PCR扩增产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis of PCR-amplified 16S rDNA gene fragmentsfrom two isolates

由图1可知，PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，分离株在1 500 bp处均出现特异性条带，与预期扩增大小一致，说明扩增成功。

测序后，将各菌株的16S rDNA基因测序结果在GenBank中进行BLAST分析，各菌株与参考菌株的同源性均达到99%以上（表1）。为显示菌株之间的亲缘关系及系统地位，MEGA5构建系统发育树（图2）。

表1 16SrDNA序列的BLAST分析结果Table 1 16S rDNA sequence analysis results of BLAST

图2 分离株16S rDNA 序列系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of two isolates

如图2所示，分离株中1 株与L. plantarum有较近亲缘性，1 株与L. rhamnosus有较近的亲缘性，且与相似菌株的相似性达到100%，故SN1鉴定为L. plantarum（NCBI登录号为KP296678），SN6鉴定为L. rhamnosus（NCBI登录号为KP296679）。

2.3 乳酸菌生物学性质

2.3.1 乳酸菌生长曲线

图3 乳酸菌的生长曲线Fig.3 Growth curves of lactic acid bacteria

由图3可知，各菌株生长迅速，L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. rhamnosus CGMCC 1.2466、L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6、L. casei CGMCC 1.2435在2 h后进入对数期，L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555在12 h后达到稳定期；L. rhamnosusCGMCC 1.2466在14 h后达到稳定期，SN1、SN6在16 h后达到稳定期，L. casei CGMCC 1.2435在18 h后达到稳定期。L. pentosus CGMCC 1.2439在4 h后进入对数期，16 h后进入稳定期。L. brevis CGMCC 1.558在6 h后进入对数期，14 h后进入稳定期。L. acidophilus CGMCC 1.1878在10 h后进入对数期，16 h后进入稳定期。

L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6、L. pentosus CGMCC 1.2439、L. rhamnosus CGMCC 1.2466、L. casei CGMCC 1.2435、L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. brevis CGMCC 1.558、L. acidophilus CGMCC 1.1878对数期的OD600nm值分别为8.47、7.43、6.93、6.76、4.67、3.94、2.09、1.43。

2.3.2 产酸性实验

产酸速率是乳酸菌活力良好的重要特征之一，也是筛选优良菌株的重要指标。由图4可知，L. rhamnosus 1.2466和L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6产酸最快，8 h后ph值降到4.2以下；L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. pentosus CGMCC 1.2439在10 h后ph值下降到4.2以下；L. casei CGMCC 1.2435在12 h后下降到4.2，L. brevis 1.558、L. acidophilus CGMCC 1.1878产酸相对较慢，36 h后ph值下降到4以下。以上菌株显示了较好的产酸能力。

图4 乳酸菌的产酸性Fig.4 Acid production rates of lactic acid bacteria

2.3.3 耐酸性实验结果

图5 乳酸菌在不同pH值培养基中培养16 h后的OD600nm值Fig.5 OD600nmvalues of lactic acid bacteria cultivated in media at different pHs for 16 h

由图5可知，L. acidophilus CGMCC 1.1878、L. pentosus CGMCC 1.2439、L. plantarum SN1在培养基ph值为6.0时OD600nm值最大，L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. brevis CGMCC 1.558、L. casei CGMCC 1.2435、L. rhamnosus CGMCC 1.2466在培养基ph值为6.5时OD600nm值最大，而L. rhamnosus SN6在ph值为6.0和6.5时均达到了最大的生长量，说明培养基在ph 6.0左右为各菌株的最佳培养条件。 ph 2.0的培养基中各菌株基本不生长；在ph 4.0的培养基中，L. plantarum subsp. plantarum CGMCC 1.555、L. brevis CGMCC 1.558、L. acidophilus CGMCC 1.1878、L. casei CGMCC 1.2435、L. pentosus CGMCC 1.2439、L. rhamnosus CGMCC 1.2466、SN1、SN6的相对OD600nm分别为3.98%、31.91%、13.58%、31.50%、56.53%、45.98%、49.29%、47.14%。综上结果，L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6均较参考菌株的相对OD600nm值高，说明L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6具有较强的耐酸能力。

2.3.4 耐胆盐实验

耐胆盐能力是乳酸菌的重要特征之一，乳酸菌要到达并定殖于肠道，必须对胆盐有一定的耐受性。由图6可知，随着胆盐质量浓度的升高，各菌株的生长受到不同程度的抑制。将菌株在0.3 g/L的胆盐质量浓度下培养16 h后，与培养基中没添加胆盐的OD600nm值相比，L. plantarum subsp. plantarum 1.555、 L. brevis 1.558、L. acidophilus 1.1878、L. casei 1.2435、 L. pentosus 1.2439、L. rhamnosus 1.2466、L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6的相对OD600nm值分别为12.81%、57.31%、34.00%、53.40%、53.66%、89.02%、57.70%、69.48%；在0.6 g/L的胆盐质量浓度下培养16 h后，与培养基中没添加胆盐的OD600nm值相比，各菌株相对OD600nm值分别为3.31%、48.84%、14.33%、 28.53%、 35.58%、27.36%、48.22%、29.56%。与参考菌株相比，L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6具有较强的耐胆盐能力。

图6 乳酸菌在不同胆盐含量培养基中培养16 h后的OD600nm值Fig.6 OD600nmvalues of lactic acid bacteria cultivated in media with different bile salt concentrations for 16 h

3 结论与讨论

酸奶经自然发酵会保留许多具有优良特性的乳酸菌，如植物乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、戊糖乳杆菌、消化乳杆菌、詹氏乳杆菌、耐酸乳杆菌、德氏乳杆菌、玉米乳杆菌、粪肠球菌、嗜热链球菌、植物乳球菌和肠膜明串珠菌[22-23]。鼠李糖乳杆菌多分离于人的粪便[24-25]、人群肠道[10]、乳酪[26]、以及发酵橄榄[27]等。本研究从自然发酵的酸奶中分离到2 株细菌，进行革兰氏染色、过氧化氢酶及16S rDNA鉴定为L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6。

乳酸菌作为发酵剂被广泛应用到食品行业，如酸奶、奶酪、风干香肠、酸菜等的生产。在发酵初期，乳酸菌快速生长且能够足量的产酸，使ph值迅速降低，这不仅对产品色泽的形成有促进作用，还能够提高产品的稳定性[28-29]和安全性[30]。本研究通过生长曲线和产酸速率指标筛选出生长迅速、产酸较快L. plantarum SN1、L. rhamnosus SN6初步可作为具有潜在发酵特性的菌株。

乳酸菌作为益生菌能否在人体内发挥益生作用，关键在于其能否在胃液的酸性环境和肠道的胆盐环境中存活下来。正常人的胃液在ph 1.5～4.5之间，其ph值的大小因食物结构不同而波动[31]。在ph 2.0时，所有菌株基本不生长；在ph 4.0时，各菌株均表现出不同程度的耐受性，L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6相对OD600nm值分别为49.29%、47.14%，且均较参考菌株的相对OD600nm值高，说明L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6具有较强的耐酸能力。这种耐酸特性是多种机制共同作用的结果，包括双组分信号转导系统、维持胞内外ph值平衡，细胞膜组成变化，蛋白质、DNA 损伤修复等[5]。

L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6具有较强的耐酸能力，能够保证一定数量的活菌体顺利通过胃酸环境到达肠道内。人体小肠中胆盐质量浓度在0.3～3 g/L之间波动，能够在正常生理胆盐质量浓度中生长和代谢的菌株才可能在肠道消化过程中存活[32]。本研究中L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6在0.3 g/L胆盐质量浓度下培养16 h后，相对OD600nm值分别为57.7%、69.48%； 在0.6 g/L胆盐质量浓度下的相对OD600nm值分别为48.22%、29.56%，均表现出一定的耐受力，且均较参考菌株的相对OD600nm值高，由此可见，L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6具有较强的耐胆盐能力。耐胆盐特性主要与自身的胆盐水解酶、表层蛋白有关[5]。

乳酸菌作为益生菌对人体具有重要的生理功能，它对胃肠道的耐受性是其发挥生理功能的基本前提。本研究所鉴定的两株乳酸菌有较强的耐酸耐胆盐能力，具有在人体内定殖的潜力，可以广泛应用在酸奶、豆类、谷物等乳酸发酵制品中，也可应用在发酵肉制品、青贮饲料中。目前，对于乳酸菌耐酸耐胆盐机制的研究已有诸多报道，但尚不完全清楚[5]。本课题组将运用同源基因克隆方法研究L. plantarum SN1和L. rhamnosus SN6中的胆盐水解酶基因等，深入分析其耐酸耐胆盐的机制。

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Identification and Selection of Lactic Acid Bacteria Resistant to Acid and Bile Salt

LI Li1, KONG Li2, ZHANG Ning2, ZHAO Weichao2, XIAO Yinong1, LI Bingxue1,*, HAN Xiaori1
(1. National Engineering Laboratory for Efficient Utilization of Soil and Fertilizer Resources, College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China; 2. College of Biological Science and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

Two strains of lactic acid bacteria were isolated from naturally fermented yogurt. The 16S rDNA sequence analysis indicated that the two strains were Lactobacillus plantarum SN1 and Lactobacillus rhamnosus SN6. These strains were studied for growth curve, acid production rate, acid and bile salt tolerance. Both of them reached a logarithmic growth phase after 2 h and a stable period after 16 h with OD600nmvalues of 8.47 and 7.43, respectively. The pH value dropped to 4.2 at 8 h and 3.3 at 48 h. L. plantarum SN1 and L. rhamnosus SN6 had strong resistance to acid, and the relative OD600nmvalue was 49.29% and 47.14% at pH 4.0 after 16 h of culture, respectively. After being cultured for 16 h at a bile salt concentration of 0.3 g/L, the relative OD600nmvalues of L. plantarum SN1 and L. rhamnosus SN6 were 57.7% and 69.48%, respectively, compared to 48.22% and 29.56% when the concentration of bile salt was 0.6 g/L. These results show that both L. plantarum SN1 and L. rhamnosus SN6 are probiotic strains with strong growth performance, acid production and tolerance to acid and bile salt.

lactic acid bacteria; acid and bile salt tolerance; 16S rDNA sequence analysis

Q935

A

1002-6630（2015）21-0123-06

10.7506/spkx1002-6630-201521024

2015-01-05

国家自然科学基金面上项目（31271818）；沈阳市科技创新农业科技攻关专项（F13-143-3-00）；

中国博士后科学基金项目（2012M510836；2013T60299）

李利（1989—），女，硕士研究生，研究方向为微生物生理与遗传。E-mail：lili2008aa@163.com

*通信作者：李炳学（1973—），男，教授，博士，研究方向为微生物生理与遗传。E-mail：libingxue1027@163.com