李冲伟，宋福强，宋 永，沈志伟

（1. 黑龙江大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150080；

2. 黑龙江大学 教育部农业微生物技术工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150080）

酒精发酵过程中电导率变化趋势解析

李冲伟1,2，宋福强2,*，宋 永1,2，沈志伟1

（1. 黑龙江大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150080；

2. 黑龙江大学 教育部农业微生物技术工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150080）

基于本实验室前期发现电导率在酒精发酵过程中存在着先降低后升高的变化趋势，采用等离子体发射光谱法等物理化学方法，研究了4 种主要阳离子质量浓度、还原糖质量浓度、乙醇体积分数、酵母细胞浓度、ph值对酒精发酵过程中电导率变化规律的影响。结果表明：4 种主要离子质量浓度、还原糖质量浓度、乙醇体积分数、酵母细胞浓度和ph值均能影响电导率的变化，其中起决定性作用的是乙醇体积分数；电导率下降的主要原因是发酵液的乙醇体积分数在持续增加；当乙醇体积分数不再增加时，电导率受到氢离子质量浓度的影响转为上升趋势。由此验证，发酵液中电导率的变化直接受乙醇体积分数变化的影响。

酒精发酵；电导率；乙醇体积分数；还原糖质量浓度

酒精生产中最重要的一步是糖化发酵环节，直接影响到产品的质量和企业的经济效益。然而发酵过程何时结束，何时将发酵液送至蒸馏车间。一直以来，人们都是采用从发酵罐取样，在实验室进行指标检验。这种离线检测，不仅错过了最恰当的排放时间，延长了生产周期，同时每4 h测定1 次乙醇含量和还原糖的工作，增加了人力、物力和财力的消耗[1]。从20世纪80年代开始，国内外专家就致力于研究发酵过程动态和终点的在线监测问题。例如，Spinnler等[2]基于ph值研究了酵母细胞活力的自动检测技术，但效果并不明显。冯金垣等[3]采用独特设计的液芯光波导浓度传感器用于在线测量乙醇浓度，但此仪器设备结构较复杂，且测量精度受电源和电路的干扰较大。杨海麟等[4]利用超声波检测原理，设计了用于乙醇含量在线监测的超声波传感器，然而该传感器受发酵液温度和杂质含量的影响较大。窦少华等[5]通过实验建立了啤酒发酵过程中电导率与几个重要发酵参数的数学模型，以期找到一种快速检测方法代替离线检测。朱艳英等[6]利用传感器测定乙醇含量和糖度的输出信号，通过模式转换从而实现糖度和乙醇含量的在线测量。王豪等[7]利用傅里叶变换近红外光谱法测定葡萄酒中的乙醇含量，期望找到一种在线测定乙醇含量的方法，该设备结构复杂且价格昂贵。王建林等[8]利用金属氧化物半导体材料为气敏元件，在发酵液中插入膜透取样器进行乙醇蒸汽的采集和检测，该仪器设备结构复杂，且误差较大。目前，仅奥地利安东帕公司的在线监测系统在啤酒发酵过程中有应用，但还没有应用到酒精发酵过程的检测，且设备价格较高。

本实验室前期研究发现，在酒精发酵周期内，发酵液的电导率曲线呈现先下降后上升的变化规律[9]，在电导率达到最低点的时刻，发酵液的乙醇体积分数和还原糖质量浓度，基本达到发酵终点的指标要求，即电导率的最低点接近发酵终点。本实验旨在研究酒精发酵过程中电导率变化的机理和影响因素，期望通过改善影响因素、构建电导率和乙醇体积分数之间更加合理的数学模型，为酒精发酵过程的在线监测寻找一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 菌种、材料与试剂

酒精酵母：安琪酿酒高活性干酵母 江苏锐阳生物科技有限公司。

玉米粉 市售，玉米碴粉碎后过40 目筛，含水量16.84%。

α-淀粉酶（酶活力3 700 U/g）、糖化酶（酶活力100 000 U/g） 南京林诺工贸有限公司；NaCl 天津科密欧化学试剂有限公司；丙酮 天津博迪化工股份有限公司；葡萄糖、CaCl2、(Nh4)2SO4、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）均为分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

Optima 7000DV等离子体发射光谱仪 美国铂金埃尔默有限责任公司；BX53奥林巴斯生物显微镜 日本奥林巴斯株式会社；Fw 100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；Jy92-IIDN超声破碎仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；EC-214电导率仪 北京哈纳科仪科技有限公司；3 L不锈钢发酵罐 瑞士比欧生物工程公司（上海）；PhS-3C酸度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒精发酵生产工艺

配料：取适量玉米粉，料液比为1∶3.5（m/V）。

液化：淀粉酶用量为56 U/g，CaCl2添加量为3.0 g/L，60 ℃条件下持续液化30 min，100 ℃条件下持续液化90 min，ph 6.0。

糖化：糖化酶用量为334 U/g， 60 ℃条件下糖化时间0.5 h，ph 4.0。

发酵：酵母接种量为3%，(Nh4)2SO4用量为1 g/L，发酵时间90 h，0～12 h发酵温度为30～32 ℃，12～72 h发酵温度为32～34 ℃，72～90 h发酵温度为30～32 ℃，采用3 L不锈钢发酵罐发酵，每次取样前搅拌。

1.3.2 酒精发酵过程中电导率与还原糖质量浓度和乙醇体积分数的测定

从制备好的糖化醪接种酵母开始，每4 h测量发酵液的电导率、还原糖质量浓度和乙醇体积分数，并绘制发酵过程中3 个参数随时间变化的关系曲线。

还原糖质量浓度的测定采用3,5-二硝基水杨酸法[10]；电导率的测定采用在线测量，每次测量前搅拌发酵液；乙醇体积分数测定采用蒸馏法[11]。

1.3.3 酒精发酵过程中相关因素对电导率的影响

1.3.3.1 几种主要离子质量浓度对电导率的影响

考虑到电导率的下降可能与发酵液中离子质量浓度的变化有关，测定了酒精发酵前期（12、24、36、48 h）发酵液中K+、Na+、Ca2+、Mg2+4 种主要阳离子的质量浓度。4 种阳离子质量浓度的测定采用等离子体发射光谱法，等离子气体流量15 L/min，辅助气体流量0.2 L/min，雾化器气体流量0.8 L/min，射频功率1 300 w，蠕动泵流量1.5 mL/min[12]。

1.3.3.2 ph值对电导率的影响

从发酵0 h开始，每4 h测量发酵液的电导率和ph值，观察两者的变化关系。同时，为了考察h+质量浓度对电导率的影响，利用不同ph值的盐酸溶液模拟酒精发酵过程中不同阶段的ph值，考察不同ph值对电导率的影响。ph值利用酸度计进行测定。

1.3.3.3 还原糖质量浓度对电导率的影响

在具有电导的溶液中分别加入不同质量的葡萄糖，模拟酒精发酵过程不同阶段还原糖质量浓度，研究酒精发酵过程中还原糖质量浓度对电导率的影响。由于葡萄糖是非电解质，本身并没有导电性，以质量浓度0.1 g/L NaCl溶液（电导率为2.45 mS/cm）替代发酵液的导电性能。取NaCl溶液，分别添加葡萄糖，制成还原糖终质量浓度为10、8、6、4、2 g/L的溶液，25 ℃条件下测定5 种不同溶液的电导率。

1.3.3.4 乙醇体积分数对电导率的影响

在具有电导的溶液中分别加入不同体积的乙醇，模拟酒精发酵过程不同阶段的乙醇体积分数，研究乙醇体积分数对电导率的影响。由于酒精是非电解质，本身并没有导电性，同样以质量浓度0.1 g/L NaCl溶液替代发酵液的导电性能。取质量浓度0.1 g/L的NaCl溶液，分别添加一定比例的无水酒精，制成乙醇体积分数为1%、3%、5%、7%、9%、11%的溶液，25 ℃条件下测定6 种溶液的电导率。

1.3.3.5 酵母细胞浓度对电导率的影响

为了考察酒精发酵过程中酵母细胞浓度对电导率的影响，取对数生长期的酿酒酵母（8.2×106CFU/mL），用无菌生理盐水溶液分别稀释0、2、4、6、8 倍，然后测定5 种稀释液中细胞的OD600nm值和电导率，OD600nm值测定采用浊度法[13]。

1.3.4 麦角甾醇含量和丙二醛浓度的测定

麦角甾醇是真菌细胞膜结构的重要组成成分，具有调节真菌细胞膜流动性的功能，在细胞膜结构的完整性、细胞活力以及物质运输等方面起着重要作用。一旦麦角甾醇缺乏，必将引起真菌细胞膜功能异常，甚至发生细胞破裂。脂质过氧化反应也是机体内重要的反应过程，一旦机体内活性氧平衡被打破，就会发生脂质过氧化反应，形成脂质过氧化产物，如丙二醛（malondialcehyde，MDA）等，使细胞膜的流动性和通透性发生改变，最终导致细胞结构和功能的改变。本实验选取了56、58、60、62、64 h作为实验时间点，测定了发酵液酵母细胞内麦角甾醇含量[14]和MDA浓度[15]，并利用显微镜观察细胞的形态变化。

1.3.5 细胞死亡数量对发酵液电导率的影响

为了测定细胞死亡数量对发酵液电导率的影响，采用TCA方法对酵母细胞溶液进行破碎，并测定破碎液的电导率，同时以不破碎的细胞溶液作对照，比较两种细胞溶液的电导率。TCA方法如下：取50 mL细胞悬液，加入5.56 mL 100%丙酮，冰浴30 min[16]。

1.4 数据处理

采用软件SPSS 11.5进行统计分析，差异显著性分析采用t检验。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中电导率与还原糖质量浓度和乙醇体积分数的变化曲线

图1 发酵过程中电导率与乙醇体积分数和还原糖质量浓度的变化关系Fig.1 Change in electrical conductivity as a function of alcohol and reducing sugar concentration during fermentation process

由图1可知，随着发酵过程的进行，乙醇体积分数逐渐上升，还原糖质量浓度逐渐下降，电导率首先呈现下降趋势，在发酵60 h附近，电导率停止下降趋势转为反弹上升。在电导率的最低点，乙醇体积分数上升到11.5%，还原糖质量浓度下降到1.433 mg/mL。

2.2 酒精发酵前期电导率下降原因分析

2.2.1 发酵液中K+、Na+、Ca2+、Mg2+质量浓度对电导率的影响

在液体中常以电导率来衡量溶液的导电性能。溶液中阳离子质量浓度越高，导电性能越强，则电导率越大[17]。由表1可知，在12～60 h，发酵液中电导率逐渐下降，而几种主要阳离子质量浓度是逐渐上升的，发酵60 h和12 h相比较，K+质量浓度上升65.19%，Na+质量浓度上升62.72%，Ca2+质量浓度上升331.3%，Mg2+质量浓度上升107.78%，由此说明，电导率的变化不是这几种阳离子质量浓度变化所引起的；在60～62 h，发酵液中电导率是上升的，而这时溶液中几种阳离子质量浓度也是上升的，K+质量浓度上升7.05%，Na+质量浓度上升19.27%，Ca2+质量浓度上升20.87%，Mg2+质量浓度上升12.70%。由此又说明，电导率的变化可能与这几种阳离子质量浓度的变化有关。

表1 不同时间发酵液中4 种阳离子质量浓度Table 1 Concentrations of four ions in fermented liquid at different fermentation times mg/L

2.2.2 ph值对电导率的影响

酒精发酵过程是溶液中的葡萄糖逐渐被利用分解，产生乙醇和其他酸性物质，导致h+质量浓度增加[18]。每4 h测量发酵液的电导率和ph值，得到ph值与电导率随时间的变化曲线，结果见图2。从0～60 h，酒精发酵过程中，电导率和ph值均呈下降趋势，电导率从5.11 mS/cm下降到3.42 mS/cm，下降1.69 mS/cm（33.07%）。ph值从3.61下降到1.24，下降2.37（65.65%）。经过60 h（电导率拐点）后，在60～64 h期间，h+质量浓度持续增加，ph值仍呈下降趋势，ph值下降10.22%，电导率停止下降转呈上升趋势，上升5.08%。在64～68 h期间，ph值减缓下降趋势，4 h内下降0.81%，电导率同时也减缓上升趋势，上升1.39%。由此说明，电导率下降速率受ph值下降速率的影响较大，这两者之间应该存在着一定的线性关系。由图3可知，ph值从4.48下降至1.84，电导率是从5.43 mS/cm逐渐上升到8.26 mS/cm，而实际发酵过程中，随着ph值下降，发酵液的电导率也是逐渐下降的，由此可知，ph值的降低会导致溶液电导率的上升，图2中60～68 h期间电导率的上升应该就是ph值下降引起的，68 h之后两者均基本不变，综上分析，ph值不是影响电导率下降的主要因素。

图2 发酵过程中pH值与电导率变化关系Fig.2 Changes in pH and electrical conductivity during fermentation process

图3 不同pH值对电导率的影响Fig.3 Relationship between electrical conductivity and pH

2.2.3 还原糖质量浓度对电导率的影响

图4 不同还原糖质量浓度对电导率的影响Fig.4 Relationship between electrical conductivity and reducing sugar concentration

由图4可知，随着还原糖质量浓度从10 g/L降到2 g/L，电导率从1.96 mS/cm上升到2.35 mS/cm，说明还原糖质量浓度的降低会导致溶液电导率的上升（这可能与葡萄糖属于非电解质有关）[19]，而实际发酵过程中，随着还原糖质量浓度的降低，电导率是下降的。由此可知，还原糖质量浓度不是导致电导率下降的主要因素。

2.2.4 酵母细胞浓度对电导率的影响

图5 不同酵母细胞浓度对电导率的影响Fig.5 Relationship between electrical conductivity and cell concentration

由图5可知，随着酵母细胞浓度（OD600nm值）的增加，电导率从0.06 mS/cm上升到0.36 mS/cm，上升0.30 mS/cm；随着酒精发酵过程的进行，发酵液的酵母细胞浓度逐渐增加，发酵液的电导率呈上升趋势，而实际酒精发酵过程0～60 h期间电导率是下降的。由此可知，酵母细胞浓度也不是导致电导率下降的主要因素，这与Meng等[20]的结论一致。

2.2.5 乙醇体积分数对电导率的影响

图6 不同乙醇体积分数对电导率的影响Fig.6 Relationship between electrical conductivity and alcohol concentration

由图6可知，随着乙醇体积分数从1%增加到11%，电导率从2.45 mS/cm下降到1.34 mS/cm，下降1.11 mS/cm（45.3%），下降变化趋势比较明显，这与酒精发酵过程中电导率的下降趋势是基本一致的。酒精溶液属于非电解质[21]，随着溶液中乙醇体积分数的增加，溶液的导电性能越差，这也正好解释了酒精发酵过程中随着乙醇的生成，电导率逐渐降低的原因。

2.3 酒精发酵后期电导率止降回升的原因分析

2.3.1 电导率拐点前后酵母细胞的形态变化

为了探究电导率拐点（发酵60 h）附近细胞形态变化对电导率的影响，本实验观察了电导率拐点前后细胞形态的变化。由图7可知，发酵56～68 h期间，细胞形态从外观上并没有出现明显的变化，酵母细胞的死亡率呈线性变化，从16.78%有规律地增加到36.96%（透明的酵母细胞为活细胞，染色的酵母细胞为死细胞）。

图7 不同发酵时间发酵液中的酵母细胞形态Fig.7 Cell morphology at during fermentation times

2.3.2 电导率拐点前后酵母细胞中麦角甾醇含量和MDA浓度的变化

图8 不同发酵时间酵母细胞中麦角甾醇含量（a）和MDA浓度（b）Fig.8 Ergosterol content (a) and MDA content (b) in yeast cells at different fermentation times

由图8a可知，发酵液酵母细胞中麦角甾醇含量从0.044 6 mg/g降到0.012 4 mg/g，下降了72.2%，并且呈线性下降趋势（R2＝0.996 8），说明细胞膜完整性和通透性的改变是一个缓慢的线性变化过程[22]。通过测定56～64 h发酵液酵母细胞中MDA浓度的变化，可以反映出细胞脂质过氧化反应的程度，即细胞膜通透性能的大小。由图8b可以看出，从56～64 h酵母细胞中MDA浓度从0.026 μmol/L上升到0.119 μmol/L，上升了357.7%，并且呈线性上升趋势（R2＝0.951 6），说明细胞过氧化反应的发生是循序渐进地进行。

3 结 论

本实验通过研究酒精发酵过程中阳离子质量浓度、还原糖质量浓度、ph值、乙醇体积分数和酵母细胞浓度等宏观变量对电导率变化的影响，得到了如下结论：通过单因素试验证明，乙醇体积分数是电导率变化的决定性因素。随着乙醇体积分数的增加，溶液的电导率下降，这与酒精发酵过程中乙醇体积分数与电导率的变化关系是一致的，这应该与乙醇属于非电解质的性质有关。

细胞的形态变化和细胞的氧化过程是循序渐进地进行的[23]，细胞形态在发酵60 h附近没有出现突变现象，从而排除了细胞水平对电导率突变的干扰。由于乙醇体积分数是影响酒精发酵过程电导率的主要因素。当乙醇体积分数停止增加后，溶液中几种重要阳离子质量浓度和h+质量浓度均保持上升趋势，这些阳离子质量浓度的增加是导致电导率上升的主要原因，特别是h+质量浓度，它的变化速率与电导率的变化速率基本一致。

目前，尽管市场上已经存在乙醇体积分数测量仪，这些测量装置运用了离线检测技术[24]，或者运用了价格昂贵的膜技术或质谱技术[25]。而利用电导率仪在线测量电导率，不仅可以及时反映发酵过程乙醇体积分数的变化和酒精发酵终点的判断，而且该方法操作简单，仪器设备价格便宜，至于电导率的精确度问题还有待于通过建立数学模型或神经网络来进一步校正。

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Change in Electrical Conductivity during Alcoholic Fermentation of Saccharified Corn Starch

LI Chongwei1,2, SONG Fuqiang2,*, SONG Yong1,2, SHEN Zhiwei1
(1. College of Life Sciences, Heilongjiang University, Harbin 150080, China; 2. Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology, Ministry of Education, Heilongjiang University, Harbin 150080, China)

The change of electrical conductivity, an initial increase followed by a decrease, during alcoholic fermentation of saccharified corn starch was observed in our previous work. This study further examined the effects of 4 main ions, reducing sugar, alcohol, cell concentration and pH on the variability of this parameter during the fermentation process. The results showed that all the above factors affected the change of electrical conductivity with alcohol concentration being the most important determinant. The decline of electrical conductivity was mainly due to the continuous increase of alcohol concentration in the fermented liquid. When alcohol concentration reached a plateau, electrical conductivity tended to increase as a result of a reduction in pH. Therefore, alcohol concentration had a direct impact on the change of electrical conductivity during the fermentation process. It is feasible to directly reflect the change of alcohol concentration by the change of electrical conductivity through the established mathematical model. The results could be applied for on-line monitoring alcoholic fermentation process and determining the end point of fermentation.

alcoholic fermentation; electrical conductivity; alcohol concentration; reduced sugar concentration

Q819

A

1002-6630（2015）21-0105-06

10.7506/spkx1002-6630-201521021

2015-05-05

国家自然科学基金青年科学基金项目（31201412）；黑龙江省博士后资助项目（LBH-Z14206）；

哈尔滨市科技创新人才研究专项基金项目（RC2012QN002095）

李冲伟（1977—），男，副教授，博士，主要从事酒精发酵过程的代谢控制及代谢产物研究。E-mail：chongweili@126.com

*通信作者：宋福强（1964—），男，教授，博士，主要从事菌根及生物废弃物开发利用研究。E-mail：sfq1968@126.com