崔素萍，许 琳，王 颖，张洪微，左豫虎

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江 大庆 163319）

超声波处理对低嘌呤脱脂豆粉巯基含量、疏水性及粒径分布的影响

崔素萍1，许 琳1，王 颖1，张洪微1，左豫虎2

（1.黑龙江八一农垦大学食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江 大庆 163319）

为研究超声波处理对低嘌呤脱脂豆粉性质的影响，利用可见分光光度计、激光粒度分布仪、荧光分光光度计进行了检测分析。结果表明：超声波处理样品的游离巯基含量、体积平均粒径、粒径分布宽度及蛋白质表面疏水性均显著高于未经超声波处理的样品（P＜0.05）。超声波功率为405 W、超声波温度50 ℃、超声波时间30 min时，游离巯基含量达到最大值8.75 μmol/g；超声波功率为450 W、超声波温度40 ℃、超声波时间60 min时，相对表面疏水性达到3.86%。因此，超声波处理引起了低嘌呤脱脂豆粉蛋白质游离巯基含量、粒径分布和表面疏水性的变化。

超声波处理；低嘌呤脱脂豆粉；巯基含量；粒径分布；表面疏水性

高尿酸血症和痛风是一种因嘌呤代谢紊乱导致人体尿酸生成异常的常见病，在过去20多年，分别以每年3.2%和1.2%的发病率速率递增[1]。限制高嘌呤食物的摄入，是传统的食物治疗方法[2-3]。目前，国内外有关低嘌呤食物的研究主要集中在低嘌呤啤酒的研制上[4-12]，而有关其他低嘌呤食物的研究较少。

脱脂豆粕是大豆榨油后的副产物，其蛋白质富含人体所需的8 种必需氨基酸，氨基酸模式接近动物蛋白，是替代动物蛋白质最好的植物蛋白质之一。与大豆相比，除脂肪外，其他营养成分基本未丢失，其中蛋白质含量达45%～50%。如能为痛风病人提供一种方便食用的低嘌呤脱脂大豆粉来补充痛风病人动物蛋白质摄入不足及提高脱脂豆粕的利用率必将有重要的意义。

超声波作为一种强化过程的手段，其产生的空化作用、机械效应和热效应等可对原料的结构和功能产生较大影响[13]。超声波技术作为辅助加工手段，已被广泛应用于食品加工企业[14-15]。

麦芽根是啤酒大麦发芽的副产物，含有磷酸二酯酶和磷酸单酯酶等多种核酸水解酶[16]，食品工业上常利用麦芽根中的核酸水解酶制备核酸的降解物[17]。

为探讨超声波处理对低嘌呤脱脂大豆粉的影响，本研究小组在前期研究工作中发现：超声波处理的低嘌呤脱脂大豆粉颗粒大部分呈球形体，且表面布满微孔；未经超声波处理的脱脂豆浆、低嘌呤脱脂大豆粉和经超声波处理的脱脂豆浆、低嘌呤脱脂大豆粉中蛋白质的β-折叠和无规卷曲的总含量分别是59.64%、52.49%、65.46%、56.21%；低嘌呤脱脂大豆粉的雄性和雌性小鼠蛋白质消化率分别是79.33%、70.03%。因此，超声波处理改变了低嘌呤脱脂豆腐粉的微观结构、蛋白质的二级结构，改善了蛋白质的营养功能。

为进一步研究超声波处理对低嘌呤脱脂大豆粉性质的影响，本实验首先利用超声波处理脱脂豆浆，然后在豆浆中添加麦芽根粉、Ca2+、Mg2+，在55 ℃条件下水浴1 h，利用麦芽根中的核酸酶水解核酸，利用壳聚糖具有吸附嘌呤的作用[18]，再添加壳聚糖对豆浆中嘌呤进行吸附去除，最后进行喷雾干燥，制备低嘌呤脱脂大豆粉。研究超声波处理对低嘌呤脱脂豆粉的巯基含量、粒径分布及表面疏水性的影响，以期为低嘌呤脱脂豆粉的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

脱脂豆粕：购于黑龙江大庆日月星公司。麦芽根粉：麦芽根由北大荒农垦麦业提供，将麦芽根粉碎过60 目筛子后，立即使用。

MgSO4天津市大茂化学试剂厂；CaSO4、NaH2PO4沈阳市华东试剂厂；无水Na2HPO4天津市科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇 天津市永大化学试剂有限公司；1-苯胺基-8-萘磺酸盐（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美国Sigma公司；以上试剂均为分析纯；黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤 天津一方科技有限公司；壳聚糖 国药集团化学试剂有限公司。

Ellamn试剂：将5,5’-二硫代双-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）溶入pH 7.0的磷酸盐缓冲溶液配制而成。

1.2 仪器与设备

722S可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；Bettersize2000激光粒度分布仪 丹东市百特仪器有限公司；RF5301荧光光度计 日本岛津公司；B-191型Büchi小型干燥喷雾仪 瑞士Büchi公司；FS-450N型超声波处理仪器 上海生析超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

将脱脂豆粕粉碎，过100 目筛子后，立即使用。

1.3.2 脱脂豆粕粉及低嘌呤脱脂大豆粉营养成分的测定

蛋白质含量：按GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》的方法测定，蛋白质的换算系数为6.25；脂肪含量：按GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》的方法测定；总糖含量：按GB/T 18738—2006《食品中总糖的测定》的方法测定。

1.3.3 低嘌呤脱脂豆粉的制备

称取脱脂豆粕粉10 g，按豆粕粉与水的比例为1∶10，用水溶解，电动搅拌机转速500 r/min，搅拌时间60 min，搅拌温度60 ℃，搅拌结束后在不同的超声波时间（0、20、30、40、50、60 min）、超声波功率（0、270、315、360、405、450 W）、超声波温度（0、20、30、40、50、60 ℃）的条件下进行超声波处理。然后，添加2%的麦芽根粉、44 mg/L的Ca2+、56 mg/L的Mg2+，在55 ℃条件下水浴1 h。然后，添加2%的壳聚糖，混合均匀后，在吸附温度为37 ℃条件下，振荡吸附120 min，然后4 000 r/min离心20 min，上清液为低嘌呤脱脂豆浆。将低嘌呤脱脂豆浆在进风温度180 ℃，出风温度90 ℃条件下进行喷雾干燥后得到低嘌呤脱脂豆粉。以不进行超声波处理，不添加壳聚糖的样品作为对照组实验。取嘌呤含量最低的喷雾干燥样品进行营养成分和嘌呤含量的测定。

1.3.4 嘌呤含量的测定

采用高效液相色谱法测定脱脂豆粕粉及低嘌呤脱脂大豆粉中嘌呤含量，测定方法参考文献[19]。

1.3.5 低嘌呤脱脂豆浆中蛋白质游离巯基含量的测定

蛋白质游离巯基含量的测定方法参考文献[20]，将经1.3.3节中制备的低嘌呤脱脂豆浆及脱脂豆浆，在4 000 r/min条件下离心20 min，取上清液1 mL，加入3 mL pH 7.0磷酸盐缓冲液和0.1 mL Ellamn试剂，混匀后于25 ℃恒温水浴中保温5 min，用可见分光光度计在412 nm波长处测定吸光度。以不加样品而加Ellamn试剂作为空白，以不加Ellamn试剂而加样品作为样品空白。游离巯基含量可通过下式计算得出。

式中：A412nm为除去样品空白和试剂空白后的吸光度；D为稀释倍数；13 600为摩尔吸光系数/（L/（mol·cm））；ρ为样品中蛋白质含量/（g/L）。

1.3.6 低嘌呤脱脂豆粉粒径分布的测定

将喷雾干燥后的样品马上用激光粒度分布仪进行粒子分布测定，测定参数为：样品折射率为1.5，介质的折射率为1.3，设置遮光率为10%～20%，测定时折光率为10%～15%。

1.3.7 低嘌呤脱脂豆粉蛋白质表面疏水性的测定

采用ANS荧光探针法[21]进行表面疏水性的测定，用Folin-酚法测定低嘌呤脱脂豆浆中蛋白质质量浓度，并用0.01 mol/L磷酸盐缓冲溶液逐步稀释至蛋白质质量浓度在0.04～0.2 mg/mL之间。取不同质量浓度稀释样品2 mL，在390 nm激发波长和470 nm发射波长条件下分别测定样品的荧光强度（FI0）和样品加入10 μL ANS溶液（8 mmol/L）后的荧光强度（FI1），FI1和FI0的差值即为FI，以蛋白质质量浓度为横坐标，FI为纵坐标作图，曲线初始阶段的斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数，记为S0。相对表面疏水性指数可以通过下式计算。

式中：S0C为未经超声波处理的对照蛋白质表面疏水性指数。

1.4 统计分析

所有实验均设3 次重复，取平均值，利用SPSS 12.0分析系统对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 脱脂豆粕粉及低嘌呤脱脂大豆粉中营养物质及嘌呤含量

表1 脱脂豆粕粉及低嘌呤脱脂大豆粉营养物质含量Table 1 Contents of major nutrients in defatted soybean powder and low-purine defatted soybean powder

脱脂豆粕粉及低嘌呤脱脂大豆粉中各营养物质含量结果见表1。脱脂豆粕粉中总嘌呤含量为253 mg/100 g，高于150 mg/100 g的标准[22]，属于高嘌呤食物。低嘌呤脱脂大豆粉中嘌呤含量为144.95 mg/100 g，属于低嘌呤食物。并且，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质含量高于脱脂豆粕粉中蛋白质的含量，脂肪及总糖含量低于脱脂豆粕粉中的含量，说明低嘌呤脱脂大豆粉是一种高蛋白、低脂肪、低嘌呤含量的适合于痛风病人食用的产品。

2.2 超声波处理对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量的影响

2.2.1 超声波功率对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量的影响

超声波温度50 ℃、超声波时间30 min，超声波功率对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量的影响见图1。随着超声波功率的增加，低嘌呤脱脂豆粉的游离巯基含量呈上升趋势，在405 W时达到最大值为8.75 μmol/g，比未超声波处理时增加了35.66%。这可能是由于随着超声波功率的增加，蛋白质变性程度增大，蛋白质二硫键断裂增加，巯基游离出来，暴露到分子的表面。而超过405 W时，含量又开始下降，可能是较大的超声波功率使变性的蛋白质分子又发生了聚集作用。经过不同超声波功率处理后，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量均高于对照组。

图1 超声波功率对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量的影响Fig.1 Effect of ultrasonic power on sulfhydryl content of low-purine defatted soybean powder

2.2.2 超声波时间对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量的影响

图2 超声波时间对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic treatment time on sulfhydryl content of lowpurine defatted soybean powder

超声波功率450 W，超声波温度40 ℃，超声波时间对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量的影响见图2。超声波时间在0～40 min时，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基的含量显著增加，在40 min时，游离巯基含量最高，比未超声波处理增加了47.46%。超声波时间在40～60 min时，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基的含量开始下降。这也可能是由于在较短的超声波时间时，蛋白质变性程度低，只有部分巯基游离出来，暴露到分子表面，随着超声波时间的延长，蛋白的变性程度增大，游离巯基含量上升。超声波时间大于40 min时，游离巯基含量下降的原因可能是变性的蛋白质又发生了凝固现象导致的。经过不同超声波时间处理后，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量均高于对照组。

2.2.3 超声波温度对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量的影响

超声波功率450 W，超声波时间40 min，超声波温度对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量的影响见图3。超声波温度在0～30 ℃时，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质的游离巯基含量呈线性增加。在30 ℃时，游离巯基含量达到最高，比未超声波处理增加了18.44%。当超声波温度大于30 ℃时，游离巯基含量开始下降，下降的原因可能是变性的蛋白质发生了聚集作用。经过不同的超声波温度处理后，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量均高于对照组处理。

图3 超声波温度对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量的影响Fig.3 Effect of temperature on sulfhydryl content of low-purine defatted soybean powder

综上所述，超声波处理后，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量均高于对照组。随着超声波功率、超声波时间、超声波温度的增加，游离巯基含量均有明显的改变。

2.3 超声波处理对低嘌呤脱脂豆粉粒径分布的影响

2.3.1 超声波功率对低嘌呤脱脂豆粉粒径分布的影响

表2 超声波功率对低嘌呤脱脂豆粉粒径分布的影响Table 2 Effect of ultrasonic power on particle size of low-purine defatted soybean powder

激光粒度仪是用等效散射光能分布来测定颗粒的大小，从理论上说，粒度分布能全面地反映样品溶液中颗粒的粗细特性和均匀程度。由表2可知，不同超声波功率处理后的样品体积平均粒径和粒径分布宽度均高于对照样品。超声波功率在270～405 W时，随着功率的增加，体积平均粒径减小，405 W时最低，且差异显著（P＜0.05）。这可能是经过超声波功率处理后，产生了辐射压强及超声波压强，使蛋白质分子变性，细胞组织变形，使生物分子断裂。随着超声波功率进一步加大，蛋白质分子又重新聚合。粒径分布宽度用以表征样品粒径的均匀程度，该比值大于1.5时，就可以认为样品是宽分布的。粒度分布宽，表示样品颗粒的粗细不均匀；反之则表示均匀[23]。由表1可知，粒径分布宽度都高于1.5，表明低嘌呤脱脂豆粉颗粒分布不均匀。超声波功率在270～405 W时，粒径分布宽度随着功率的增加而升高，低嘌呤脱脂豆粉颗粒的分布变得更不均匀。

2.3.2 超声波时间对低嘌呤脱脂豆粉粒径分布的影响

表3 超声波时间对低嘌呤脱脂豆粉粒径分布的影响Table 3 Effect of ultrasonic treatment time on particle size of lowpurine defatted soybean powder

由表3可知，不同超声波时间处理后样品的体积平均粒径和粒径分布宽度均高于对照样品。超声波时间20～40 min时，随着超声波时间的延长，低嘌呤脱脂豆粉的体积平均粒径显著减小；超声波时间40～60 min时，低嘌呤脱脂豆粉的体积平均粒径显著增大。长时间的超声波处理可能破坏了蛋白质分子稳定的结构，蛋白质分子发生了聚合，使得粒径变大。超声波时间对低嘌呤脱脂豆粉粒径分布的影响差异显著。粒度分布宽度大于1.5，表明低嘌呤脱脂豆粉的分布是不均匀的。超声波时间为60 min时的低嘌呤脱脂豆粉粒径分布宽度比超声波时间20 min的低嘌呤脱脂豆粉粒径分布宽度有所降低。表明超声波处理后使溶液中蛋白质颗粒在溶液中所占的体积分数增加，故而使得溶液的分散性增强[23]。

2.3.3 超声波温度对低嘌呤脱脂豆粉粒径分布的影响

表4 超声波温度对低嘌呤脱脂豆粉粒径分布的影响Table 4 Effect of temperature on particle size of low-purine defatted soybean powder

超声波温度对低嘌呤脱脂豆粉粒径分布的影响如表4所示，不同超声波温度处理后样品的体积平均粒径和粒径分布宽度均显著高于对照样品。超声波温度为20～40 ℃时，随着温度增加，低嘌呤脱脂豆粉的体积平均粒径显著减小；超声波温度40～60 ℃时，低嘌呤脱脂豆粉的体积平均粒径显著增大。这可能是由于超声波温度的升高，破坏了低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质有序的紧密结构，使其破碎成更小的粒子。随着超声波温度的进一步升高，变性的低嘌呤脱脂豆粉发生了凝胶作用，变成了较大的颗粒。由表4可知，不同超声波温度的粒径分布宽度均显著大于1.5，表明低嘌呤脱脂豆粉颗粒的分布是不均匀的。

2.4 超声波处理对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质表面疏水性的影响

图4 超声波功率对低嘌呤脱脂豆粉相对表面疏水性的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on surface hydrophobicity of lowpurine defatted soybean powder

2.4.1 超声波功率对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质表面疏水性的影响超声波温度50 ℃、超声波时间30 min，超声波功率对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质表面疏水性的影响见图4。超声波功率在270 W时，相对表面疏水性达到最大值，比未超声波处理的样品提高了71.26%，且超声波处理均高于对照。这可能是由于超声波处理使低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质结构受到了破坏。刘坚等[21]认为是蛋白质分子内部疏水相互作用逐渐受到破坏，更多的疏水性区域暴露，增加了蛋白质的表面疏水性。超声波功率360 W，相对表面疏水性为最小值；刘坚等[21]认为这可能是由于蛋白质分子间相互作用形成更多的蛋白质聚集体，导致表面疏水性下降。经过不同超声波功率处理后，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质相对表面疏水性均高于对照组。

2.4.2 超声波时间对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质表面疏水性的影响

图5 超声波时间对低嘌呤脱脂豆粉相对表面疏水性的影响Fig.5 Effect of ultrasonic treatment time on surface hydrophobicity of low-purine defatted soybean powder

超声波功率450 W、超声波温度40 ℃，超声波时间对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质表面疏水性的影响见图5。超声波时间在60 min，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质的表面疏水性达到了最大值为3.86%。超声波时间在20～40 min时，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质的表面疏水性随着时间的延长而逐渐下降；超声波时间在40～60 min时，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质的表面疏水性随着时间的延长而逐渐增大。蛋白质表面疏水性的变化与蛋白质分子发生折叠或伸展有关，当蛋白折叠时，其表面疏水性降低；当蛋白伸展时，其表面疏水性增加。经过不同超声波时间处理后，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质表面疏水性均高于对照组。

2.4.3 超声波温度对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质表面疏水性的影响

图6 超声波温度对低嘌呤脱脂豆粉相对表面疏水性的影响Fig.6 Effect of temperature on surface hydrophobicity of low-purine defatted soybean powder

超声波功率450 W、超声波时间40 min，超声波温度对低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质表面疏水性的影响见图6。超声波处理可提高低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质的表面疏水性。超声波温度20 ℃时相对表面疏水性最大，可能是由于疏水性集团暴露在蛋白质分子表面从而疏水性增加[24]。超声波温度大于20 ℃后，疏水性的降低可能是超声波温度的增加使部分蛋白质与蛋白质分子之间的疏水性增加，使蛋白质发生了聚集，蛋白质表面暴露的疏水性基团减少所致[25]。经过不同超声波温度处理后，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质表面疏水性含量均高于对照组。

3 结论与讨论

经过超声波处理后，低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质游离巯基含量、表面疏水性及低嘌呤脱脂豆粉的粒径分布均发生了改变，且均高于未经超声波处理的对照样品。

结合本团队前期的研究结果可知，低嘌呤脱脂豆粉性质改变的原因是由于超声波处理导致了低嘌呤脱脂豆粉中蛋白质二级结构的变化，蛋白质产生了变性作用，变性后的蛋白质内部疏水性基团及巯基暴露，并且变性的蛋白质会产生凝聚现象。超声波处理过程中，低嘌呤脱脂豆粉蛋白质分子二级结构、微观结构，营养功能及低嘌呤脱脂豆粉的性质都发生了改变、且变化情况复杂。低嘌呤脱脂豆粉蛋白质二级结构的改变是引起低嘌呤脱脂豆粉微观结构，营养功能及功能性质改变的原因之一，有关低嘌呤脱脂豆粉结构和功能特性的相互关系有待进一步研究。

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Influence of Ultrasonic Treatment on Sulfhydryl Content, Surface Hydrophobicity and Particle Size of Low-Purine Defatted Soybean Powder

CUI Suping1, XU Lin1, WANG Ying1, ZHANG Hongwei1, ZUO Yuhu2
(1. College of Food Science, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China; 2. College of Agronomy, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

In this research the influence of ultrasonic treatment on low-purine defatted soybean powder was analyzed using visible spectrophotometer, laser particle size distribution analyzer and fluorescence spectrophotometer. Results suggested that free sulfhydryl content, average particle size, size distribution width and protein surface hydrophobicity of the sample after ultrasonic treatment were significantly higher than those of control samples without ultrasonic treatment (P ＜ 0.05). Treatment with an ultrasonic power of 405 W at 50 ℃ for 30 min yielded maximum sulfhydryl content of 8.75 μmol/g. Protein surface hydrophobicity of 3.86% was obtained when the ultrasonic treatment was performed by irradiation with 450 W ultrasonic waves at 40 ℃ for 60 min. Therefore, ultrasonic treatment can change sulfhydryl content, particle size distribution, and protein surface hydrophobicity of low-purine defatted soybean powder.

ultrasonic treatment; low-purine defatted soybean powder; sulfhydryl content; particle size distribution; surface hydrophobicity

TS229

A

1002-6630（2015）21-0050-06

10.7506/spkx1002-6630-201521011

2015-01-12

黑龙江省农垦总局科技局科技攻关计划项目（HNK125B-13-03）；黑龙江省教育厅高等教育教学改革项目（JG2012010458）

崔素萍（1968—），女，教授，博士，研究方向为食品营养与质量安全。E-mail：cuisup@163.com