郑婷璐，戴志远，方旭波，陈小娥

（1.浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山316022；2.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310035）

石墨烯作为新型固相萃取填料结合UPLC-MS/MS测定黑鱼中13种磺胺类药残

郑婷璐1，戴志远2，方旭波1，陈小娥1

（1.浙江海洋学院食品与医药学院，浙江舟山316022；2.浙江工商大学食品与生物工程学院，浙江杭州310035）

建立了以石墨烯为固相萃取填料，结合高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术测定黑鱼中磺胺类兽药残留的检测方法。采用甲醇作为提取溶剂，经石墨烯固相萃取柱净化富集，质谱采用电喷雾正离子源，多反应监测模式。方法的线性良好，相关系数大于0.998，检出限范围0.048～0.288μg/kg，定量限为0.160～0.960μg/kg，线性范围内的加标回收率为70.6%～93.8%。本方法灵敏、可靠、稳定，满足复杂水产品基质中磺胺类药残检测的需要。

石墨烯，黑鱼，磺胺类药残，固相萃取，液相色谱-质谱联用

磺胺类药物是具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，它具有效价高、抗菌谱广、性质稳定等优点。但是由于不合理的使用会容易引起其耐药菌的增加，而且动物性食品中残留的磺胺也会对人体健康造成潜在危害。为了保证食品安全，欧盟对食品中的磺胺类兽药制定了最高允许量，单个磺胺类药物的浓度不得超过25μg/kg，磺胺类兽药总量不得超过100μg/kg[1]。因此，建立一种快速有效的磺胺检测方法非常重要。

在残留分析中，固相萃取由于其回收高、萃取时间短、溶剂用量少等特点成为一种有着广泛应用前景的前处理技术。然而，常用的固相萃取吸附剂，如C18、硅胶等往往只适用于数量有限的样品。因此，开发一种新型的固相萃取吸附剂具有较高价值。

石墨烯是近年来发现的一种二维碳原子晶体[2-3]，是已知最薄的材料之一。研究发现石墨烯在机械性能、导电能力、热力学等性质上均能表现出良好的应用前景[4-6]。除此之外，石墨烯具有巨大的比表面积和二维平面结构[7]，为吸附提供了可能，因此石墨烯作为一种吸附剂成为近几年的研究热点。其中已经有研究成功利用石墨烯作为分散剂[8]、固相微萃取填料[9-10]和固相萃取填料[11-13]对各类目标化合物进行吸附萃取，表明石墨烯可以作为一种吸附性良好的萃取剂对样品进行前处理。

目前，国内外关于液相色谱法或液质联用技术检测磺胺残留的报道文献很多，比如国内有研究采用固相微萃取剂[14]、液相微萃取[15]、基质固相分散[16-17]等测定磺胺类药残；国外有研究利用商业化的HLB固相萃取小柱对多种样品净化富集后测定磺胺类药残[18]，但是由于磺胺类药物种类较多，前处理时间长，有机试剂使用量大而且成本高（商业固相萃取柱多为一次性），而且以石墨烯作为固相萃取填料检测水产品中磺胺的研究报道很少。本实验是在此基础上研究建立一种以石墨烯为固相萃取填料同时检测水产品中多种磺胺类药残的方法，以期为生产实践提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

黑鱼购于杭州物美超市；甲醇、乙腈和甲酸色谱级，德国Merck公司；13种磺胺类标准品购自Sigma-Aldrich公司，纯度≥99%，分别为磺胺氯达嗪 （Sulfachloropyridazine，SCP）、磺胺甲恶唑（Sulfamethoxazole，SMX）、磺胺甲嘧啶（Sulfamerazine，SMR）、磺胺异恶唑（Sulfisoxazole，SIZ）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，SMZ）、磺胺对甲氧嘧啶（Sulfameter，SME）、磺胺多辛（Sulfadoxin，SDX）、磺胺喹恶啉（Sulfaquinoxaline，SQX）、磺胺噻唑（Sulfathiazole，STZ）、磺胺间甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺二甲氧哒嗪（Sulfadimethoxin，SDM）和 磺 胺 甲 氧 哒 嗪（Sulfamethoxypyridazine，SMP）；石墨纯度≥98%，Fisher Scientific公司；3mL固相萃取柱上海安谱公司。

S-4700型扫描电镜日本日立公司；高速冷冻离心机德国Thermo公司；Milli-Q超纯水净化系统美国Millipore公司；固相萃取仪美国Supelco公司；Acquity UPLC液相色谱美国Waters公司；4000QTrap三重四级杆质谱仪美国应用生物系统公司。

1.2实验方法

1.2.1石墨烯的制备采用Hummers方法[19]制备氧化石墨烯（GO），然后将100mg氧化石墨烯分散于100mL水溶液中，超声1h后移入烧瓶中，加入2mL水合肼于95℃水浴中冷凝回流24h[20]，抽滤得到的黑色粉末分别用甲醇和水清洗多次，最后冷冻干燥得到石墨烯保存备用。

1.2.2样品提取与固相萃取取（2.00±0.05）g样品于50mL离心管中，加入10mL甲醇后超声提取10min，12000r/min下离心10min，将上清液转移至梨形瓶中，于45℃旋转蒸发至干[21]。加1mL甲醇-超纯水（v/v 2/3）溶解，将溶液转移至2mL离心管中，加入1mL正己烷，涡旋振荡2min，12000r/min下离心10min，去除上层正己烷层，取下清液过固相萃取柱。固相萃取采用自制的石墨烯填料固相萃取柱（15mg，3mL），使用前用甲醇活化。样品溶液以1～2mL/min的速度过固相萃取柱，用1mL 5%甲醇水溶液淋洗，减压抽干后用适当的有机试剂洗脱磺胺类化合物，洗脱液在45℃下旋转蒸发至干。最后用1mL初始流动相溶解，0.22μm滤膜过滤以供进样。

1.2.3标准曲线磺胺标准储备液（100μg/mL）保存于4℃条件下，再依次用黑鱼空白样品基质提取液（按照1.2.2处理）稀释成1、5、10、25、50、100μg/kg浓度的标准溶液。平行3次测定，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.4回收率与精密度实验加标回收率采用三个浓度添加水平下（分别为10、25、50μg/kg）测得，日内精密度重复实验六次测定得到，日间精密度连续六天重复进样测得。

1.3液质条件

1.3.1液相条件采用Acquity UPLC BEH C8柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；流动相：A为0.1%甲酸，B为乙腈。梯度洗脱程序如表1所示，流速为0.4mL/min，进样体积为2μL。

表1　磺胺类化合物液相色谱梯度洗脱程序Table.1　Gradient elution program of thirteen SAs

1.3.2质谱条件以100ng/mL磺胺标准溶液针泵进样，在全扫描模式（Full-Scan）下确定被测化合物的母离子，然后通过子离子扫描模式（Product Ion-Scan）下确定两对定性与定量的子离子，并且对离子源参数以及去簇电压、碰撞电压和碰撞室出入口电压等质谱参数进行了优化。最终确定质谱条件：ESI+离子源；多反应监测模式（MRM）；离子源温度500℃；喷雾电压4500V；气帘气241kPa；雾化气241kPa；加热气414kPa，13种磺胺类化合物定量以及辅助定性离子对参数见表2。

1.4数据处理

数据采集与处理通过仪器配套的Analyst 1.5.1软件进行分析。

2　结果与分析

2.1石墨烯的表征-扫描电镜分析

石墨烯采用Hummers方法制备，通过水合肼还原后的石墨烯得率较高（达到70%以上）。图1为石墨烯的扫描电镜图。从图1中可以看出，在放大50000倍数下，实验合成的石墨烯非常薄，表面较平整，具有较大的比表面积，为吸附提供了可能性。但是从图中发现仍然存在不少褶皱和重叠之处，这可能是在合成过程中部分石墨烯发生团聚造成。

表2　优化后的质谱参数Table.2　Optimized MS/MS parameters

图1　石墨烯扫描电镜图（50000×）Fig.1　The SEM image of graphene（50000×）

2.2固相萃取条件的优化

通过实验发现，13种磺胺类化合物的回收率变化趋势基本一致，所以本实验以磺胺氯哒嗪、磺胺对甲氧哒嗪和磺胺甲氧哒嗪的回收率为例（下同）进行分析讨论。

2.2.1洗脱溶剂的选择洗脱液的选择直接关系到样品最终的回收率，由图2可知，相较于其他洗脱溶剂，丙酮的洗脱能力更胜一筹，但是仍未达到理想的回收效果，经多次实验发现，在丙酮中添加少量氨水具有更好的洗脱效果，这可能是因为磺胺类化合物在碱性条件下，仲氨基N的H+解离能力增加[22]，添加氨水后呈碱性更容易被洗脱下来。因此，本实验采用含氨的丙酮作为洗脱溶剂。

图2　洗脱溶剂对磺胺回收率的影响Fig.2　The effect of the eluent type on the recovery of SAs

2.2.2洗脱体积的选择在选择相同洗脱溶液的条件下，由于磺胺类化合物在石墨烯填料上的吸附能力不同，因此所需的洗脱液洗脱体积不同，洗脱体积过少导致化合物不能完全被洗脱下来，体积过多不仅浪费试剂，且可能将一些强保留的化合物洗脱下来[23]。由图3可知，随着洗脱体积的增加，磺胺类化合物的回收率也随之增加，当洗脱液体积达到3mL以后对磺胺化合物的回收率变化不明显，表明此时大部分磺胺类化合物已经被完全洗脱下来。因此，本实验选择使用3mL作为最佳洗脱液体积。

图3　洗脱体积对磺胺回收率的影响Fig.3　The effect of the eluent volumn on the recovery of SAs

2.2.3石墨烯填料质量的选择在进行固相萃取的过程中，使用不同质量的石墨烯填料对于目标化合物的回收率有比较大的影响。往往填料太多会造成吸附力过强而不容易洗脱，太少则会使目标物在上样过程中直接损失。由图4可知，当石墨烯的质量达到15mg时，能达到比较理想的回收效果，而当质量增加至15mg以后对磺胺类化合物的回收率变化影响不大。因此，本实验选择15mg的石墨烯作为最佳填充质量。

图4　石墨烯质量对磺胺回收率的影响Fig.4　The effect of the amount of graphene on the recovery of SAs

2.3液质条件的优化

在13种磺胺类化合物中，磺胺多辛（SDX）和磺胺二甲氧哒嗪（SDM）、磺胺间甲氧嘧啶（SMM）和磺胺甲氧哒嗪（SMP）具有相同的分子量，分别为311和281，通过二级质谱能得到不同的离子对，从而将不同的目标化合物分离，每个目标化合物选取2对离子对，其中响应较强的为定量离子对，响应较弱的为定性离子对。在选择电压时，如果电压太小则不能产生有效子离子，若电压过大则会造成碎片离子过多而找不到目标子离子[1]，因此对质谱电压等条件进行优化非常有必要。优化后磺胺类化合物的质谱采集电压等参数见表2，其中优化后液质的多反应监测图见图5，如图所示，磺胺类化合物的的峰型和分离度都较好，基质干扰较小，分离时间仅需12min，其中磺胺二甲氧嘧啶离子对（SDM）的响应最强，磺胺氯哒嗪离子对（SCP）的响应相对最弱。

图5　磺胺标准液的多离子反应监测图Fig.5　MRM chromatograms for the standards of SAs

2.4与其他填料比较

为了探究石墨烯的吸附性能，本实验比较了石墨烯与C18、多壁碳纳米管等其他常用填料对磺胺类化合物的吸附性（均在各自优化条件下）。由图6可知，石墨烯对磺胺类化合物的回收率最高（达到90%以上），C18次之（在80%～85%之间），而多壁碳纳米管的回收率最低（在75%～80%之间），说明相较于其他两种填料，石墨烯具有更强的吸附能力，同时所消耗的填料质量与洗脱剂用量相较于其他两种填料也是最少的。

图6　石墨烯与其他填料的萃取效果比较Fig.6　Comparison of graphene-based SPE with other sorbents

表3　磺胺类化合物的线性方程、范围及检出限和定量限Table.3　Linear equation，LOD and LOQ of SAs

2.5方法学验证

2.5.1线性方程、相关系数、检出限和定量限磺胺类化合物的线性方程及相关系数见表3，线性方程的相关系数R2均在0.998以上，线性范围1～100μg/kg，13种磺胺类化合物的方法检出限为0.048～0.288μg/kg，定量限为0.160～0.960μg/kg，可以满足供试样品定量分析的需要。

表4　磺胺类化合物三种浓度添加水平下回收率、日内和日间精密度Table.4　The recovery，precision of intra-day and inter-day of SAs in three concentrations

2.5.2加标回收率与精密度由表4可以看出，13种磺胺类化合物的回收率和精密度较好，回收率在70.6%～93.8%之间，日内精密度和日间精密度分别不超过4.6%和6.7%，能够满足方法的要求。

2.6样品检测

采用1.2.2前处理方法，对从超市购买的十批次黑鱼进行了检测，检测结果反映了水产养殖业对磺胺类药物的使用状况。在部分批次黑鱼样品中同时检出磺胺甲嘧啶（≤0.12μg/kg）、磺胺嘧啶（≤0.15μg/kg）和磺胺二甲嘧啶（≤0.28μg/kg），但是含量检出浓度小于定量限。这些药物可能是由人类代谢物进入生态循环系统引起，也可能是养殖户在养殖过程中投放使用导致。

3　结论

建立了以石墨烯为新型固相萃取填料，同时测定水产品中13种磺胺的超高效液相色谱-串联质谱的分析方法。水产品通过石墨烯固相萃取柱的净化富集后，采用液质联用方法进行分析，方法的线性良好，回收率较高，精密度以及检出限、定量限均能达到方法检测需要，与其他填料相比，采用石墨烯作为固相萃取填料对磺胺类药残进行吸附净化具有更高的回收率，更少的溶剂用量，更小的基质干扰（检出限较低），适用于在复杂水产品基质中的磺胺类药物残留的检测分析。

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Graphene as a novel SPE adsorbent coupled with UPLC-MS/MS for the determination of sulfanilamide residues in black fish tissues

ZHENG Ting-lu1，DAI Zhi-yuan2，FANG Xu-bo1，CHEN Xiao-e1
（1.College of Food and Pharmacy，Zhengjiang Ocean University，Zhoushan 316022，China；2.College of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China）

A rapid method for the simultaneous determination of thirteen sulfonamide（SAs）in black fish had been developed.The samples were extracted by MeOH and enriched by solid-phase extraction using a novel material-graphene as the sorbent.Chromatography separation was performed by UPLC and the detection was achieved by tandem mass spectrometry using ESI+and MRM mode.The method had a good linear range and the correlation coefficient was greater than 0.998.The limit of detection（LOD）ranging from 0.048 to 0.288μg/kg and the limit of quantization（LOQ）ranging from 0.160 to 0.960μg/kg were obtained.Average recoveries of individual sulfonamide were btween 70.6%and 93.8%.The proposed method was sensitive，effective and stable，which was satisfied with the need in application of detection of SAs residues in various aqutic matrixes aquatic products.

graphene；black fish；sulfonamide residues；solid-phase extraction；liquid chromatography-tandem mass spectrometry

TS201.1

A

1002-0306（2015）04-0071-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.04.006

2014－09－23

郑婷璐（1987-），女，硕士研究生，助理实验师，研究方向：水产品质量与安全。