信吉阁,曾养志

(1.云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明 650201；2.云南省版纳微型猪近交系重点实验室,云南昆明 650201)



高通量RNAi及其在细胞生物学特性研究中的应用

信吉阁1,2,曾养志2

(1.云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明 650201；2.云南省版纳微型猪近交系重点实验室,云南昆明 650201)

高通量RNAi(high-throughput screens HTSs)技术是近年来基因功能研究的高效工具。现已在多个物种的细胞内进行了大量基因组范围RNAi高通量筛选，用于研究多种不同的生物学过程，为生物医学研究提供了技术基础。就高通量RNAi技术原理、实验操作及其在研究与细胞生物特性相关基因中的主要应用进展进行了综述。

RNAi；高通量；细胞学

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是高通量分析基因功能的有效工具。近年来在果蝇和哺乳动物细胞内进行了许多基因组RNAi高通量筛选(RNAi high-throughput screens ,HTSs)，用于研究多种不同的生物学过程，包括信号传导、癌生物学、宿主细胞对感染的反应等。利用RNAi HTSs发现了许多生物过程中的结构组分，并对复杂的生物系统提出了一些新的理论，进而形成具有创新性的研究细胞功能的方法。笔者对高通量RNAi技术原理、试验操作及其在研究与细胞生物特性相关基因中的应用进行了综述。

1 高通量RNAi筛选

RNAi是RNA依赖的基因沉默现象，是双链RNA (double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA 水平上诱导的序列特异性的转录后基因表达沉默，可对内源或外源dsRNA发生反应，以序列特异的方式下调(降低但不消除)靶RNA[1-2]。2006年诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家Andrew Fire 和Craig Mello，以表彰他们发现了RNAi机制。近年来在此领域开展了多个方向的研究，如21～28 nt长度的小RNA的起源和功能研究，包括microRNAs(miRNAs)、内源短干扰RNAs(endo-siRNAs)等，这些研究从崭新的角度阐明了一些生物学观点[3-5]，同时RNAi诱导产物也已应用于医学治疗[6]。RNAi作为在mRNA水平进行特异敲除的分子工具，广泛应用于细胞、组织、器官的基因功能研究，如秀丽线虫、果蝇、哺乳细胞、扁虫、拟南介等[7-10]。

RNAi技术与DNA和基因测序数据结合，有希望构建RNAi反应物全基因组文库，广泛应用于多种细胞类型中[11]。HTSs技术可在全基因组范围内系统地研究特定细胞表型对应的内在功能基因，进行系统功能分析，突破了先前只能在相对小的范围内选择易操作的模型器官中进行的局限，同时可在多基因互作下分析药物作用，得到用于临床药物治疗效果评价的标志基因或药物治疗的新靶点基因[12]。在此领域最重要的应用是能够在哺乳动物细胞中进行全基因组范围RNAi HTSs。目前在哺乳动物细胞中进行RNAi筛选已经得到了大量有重要生物医学意义的结果，包括鉴定新的致癌基因、可能的靶位点，医学治疗等[13-15]。

2 高通量RNAi筛选实验方法

在研究某一基因的功能时，可利用RNAi下调该基因表达，直接或间接检测到基因表型和功能的改变。RNAi既可用于小范围的基因研究也可用于高通量基因筛选。以细胞为基础的RNAi HTSs，通常有2种可供选择的筛选方式，一种是合并的形式，文库以随机的方式引入细胞，一种是排列的形式，在微量滴定板每个孔上分别转染单个基因[16]。这2种方法都已成功地应用到研究中。合并方法在标准实验室设备下比阵列筛选更可行，阵列筛选需要自动化和特殊的阵列读出仪器，但阵列筛选在检测后，可通过数据库或电子数据表简单地查找在已知测定孔反应物特征，很容易判定哪些细胞是由哪些特异RNAi反应物处理的。

特异的下调的RNAi反应物在不同细胞类型、组织、不同测定法中也不同，在细胞基础的HTSs采用的典型的四类型的RNAi反应物是dsRNAs、siRNAs、shRNAs、esiRNAs。不同细胞类型适宜的导入系统也不同。常见的导入系统包括shRNAs病毒转导，shRNAs、siRNAs、esiRNAs或dsRNAs脂介质转染或电转[16]，或对于果蝇细胞可简单地把细胞和dsRNAs在溶液中混合。在RNAi HTSs中需要考虑一些重要因素，包括进行至少1次重复试验，选择适宜对照，数据质量早期评估等[17]。

3 高通量RNAi筛选的应用

尽管与其他经典基因筛选相比， RNAi HTSs还处于发展初期，但已开展了大量研究，并对许多领域产生了重要影响，尤其是在细胞功能、信号转导、癌症生物学等方面。在果蝇和哺乳动物细胞中已对多种细胞生物过程进行了研究。

3.1 细胞活力和扩增细胞扩增和存活与人类疾病，如癌症有特别的关系。现已建立起完善的以自动方式检测细胞数量、活力和基本代谢的常规方法。早期细胞基础RNAi HTSs研究中，进行了大量筛选用以鉴定与细胞扩增，存活相关的基因[18]。而近期研究已筛选出多种与哺乳动物细胞生存和扩增相关的基本因子，特别是癌症细胞的基本因子[19]。这些研究都表明在多种细胞类型中有几个基因与细胞存活或扩增相关。

3.2 细胞分裂、细胞死亡和细胞周期采用混合式筛选或简单可行的试验可检测细胞增殖或活力变化，利用特异报告子、细胞循环FACS分析或以图像为基础的检测读出器可揭示出与细胞分裂、细胞死亡或相关过程有关的特异表型。这些研究结果包括发现许多人类激酶、磷酸酶、蛋白质是与蛋白水解相关的[20]；许多蛋白与中心体增殖有关[21]；早期esiRNA为基础的筛选在人类HeLa细胞中鉴别了多种与有丝分裂和细胞质分裂等方面相关的候选基因[22]。

3.3 细胞死亡和生理节奏在哺乳动物细胞中的一项研究表明，许多基因需要RIP1激酶介导细胞坏死和细胞凋亡[23]。细胞死亡也是在果蝇细胞中进行筛选的特异热点[24]，与新陈代谢调节子如Charlatan和ARD1在半胱天冬酶激酶有关[24]。此外，人类昼夜节律钟中激酶和磷酸激酶研究发现酪蛋白激酶2能被PER2磷酸化。钙在细胞功能上的作用也集中在果蝇细胞的多个RNAi HTSs研究中，在这些研究发现了钙通道和内环境稳定性[25]。

3.4 细胞压力反应许多筛选分析了细胞对压力条件的反应，如一项关于果蝇基因RNAi HTSs研究中，检测细胞对低氧环境的反应，发现了Tor通路组分和蛋白酪氨酸磷酸酯酶61F，在低氧反应翻译的调节中起重要作用[26]。此外，全基因组综合扫描哺乳动物基因，发现某些基因的下调能产生对压力的耐受性[27]。

4 展望

应用RNAi HTSs发现了许多新基因，并已成功地应用于研究许多重要的生物学问题。RNAi HTSs的研究结果验证了许多基因与特定的过程相关的这一观点，如细胞活性、信号转导、宿主病原体相互作用等，与筛选获得的不同通路和复合体高度联系又相互独立。然而高效的RNAi筛选仍需要大规模的试验验证和高效的RNAi试剂的支持，对高通量的验证方法以及在体内证实RNAi结果是有意义的研究方向。随着基因、转录组、蛋白质组学等相关技术的发展，RNAi HTSs将作为基因功能研究的有效工具，为生物和生物医学作出更多贡献。

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RNAi High-throughput Screens and Its Application in Cell Biology Research

XIN Ji-ge1,2, ZENG Yang-zhi2

(1. Animal Science and Technology College, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201; 2. Key Laboratory of Banna Mini-pig Inbred Line of Yunnan Province, Kunming, Yunnan 650201)

RNAi high-throughput screens(HTSs) is an effective tool for analysis of gene function in genome-scale. Now a number of genome-scale RNAi HTSs have been done in cultured cells of many species to study diverse biological processes. The RNAi HTSs have made important contributions to the developments of biomedicine. The RNAi technology principle, experimental manipulation and its application in the related gene of cell biology research were reviewed.

RNAi; High-throughput screens; Cytology

国家自然科学基金项目(31360532)；云南省应用基础研究计划项目(2013FB041)。

信吉阁(1981- )，女，吉林桦甸人，实验师，博士，从事胚胎生物技术研究。*通讯作者，教授，从事遗传学方面的研究。

2014-12-02

S 188

A

0517-6611(2015)02-012-02