蔡 轶，魏 沁，蔡跃鹏，赵 莉*

(1.广州医科大学药学院蛇毒研究所，广州511436;2.华南师范大学化学与环境学院，广州510006)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我国南部及东南亚地区最常见的头颈部肿瘤之一，近年来其发病率有逐年增长的趋势［1］. 目前，临床上主要采用放疗联合化疗的治疗方法.然而，由于鼻咽癌的好发位置隐蔽，早期症状不明显，大多数鼻咽癌患者发现时已到中晚期，不仅预后不理想且不良反应大［2］.因此，寻找高效低毒的化疗药物来辅助治疗鼻咽癌是目前研究的主要方向之一.

儿茶素类化合物(catechins)是茶多酚(tea polyphenols，TP)中的主要活性成分，约占茶多酚总量的60% ～80%.表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)由于在茶叶中含量丰富并具有较强的抗肿瘤活性而引起广泛关注［3］.研究证明ECG 可抑制肝癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤细胞的增殖，并诱导其凋亡［4］，然而ECG 在鼻咽癌发生和发展过程中的作用研究报道较少. 本实验采用鼻咽癌细胞株C666-1 作为研究对象，通过观察不同浓度ECG 对C666-1 细胞增殖和凋亡的影响，初步探讨ECG 治疗鼻咽癌的可能性，为进一步研究ECG 调控鼻咽癌细胞增殖与凋亡的具体分子机制提供依据.

1 研究方法

1.1 材料与试剂

鼻咽癌细胞株C666-1 由南方医科大学基础医学院姚开泰院士惠赠. ECG(纯度＞98%)购自Sigma-Aldrich 公司，用超纯水配成100 nmol/L 储存液，－20 ℃避光保存;DMEM 高糖培养基和新生牛血清购自Gibco 公司.Cell Counting Kit-8(CCK-8)购自日本同仁化学研究所;一步法TUNEL 细胞凋亡原位检测试剂盒购自南京凯基生物技术发展有限公司;Bax兔单抗，Bcl-2 兔单抗和Caspase3 兔多抗分别购自基因有限公司(CST);β-actin 小鼠单抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗分别购自广州市洁利生物医学有限公司(Santa Cruz);ECL 化学发光试剂(Thermo Scientific)购自广州赛哲生物科技有限公司;细胞凋亡AnnexinV－FITC 荧光检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司.

1.2 细胞培养

采用含10%新生牛血清的DMEM 高糖培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱内培养鼻咽癌C666-1 细胞.根据实验要求，取对数期生长细胞接种至细胞培养板中，处理前细胞进行血清饥饿12 h，随后无血清条件下给予不同浓度ECG，并进行后续实验.

1.3 CCK-8 法检测细胞增殖

将人鼻咽癌C666-1 细胞均匀接种于96 孔板，血清饥饿12 h 后，给予不同浓度(0、12.5、25、50、100 μmol/L)ECG 继续处理48 h，每组设6个平行孔.处理结束后，每孔加入10 μL CCK-8 试剂，在培养箱内孵育1 h 后，450 nm 波长处测定OD 值，并通过与正常对照组相比来计算细胞增殖. 增殖率=OD实验/OD对照×100%.

1.4 TUNEL 法检测细胞凋亡

不同浓度(0、25、50、100 μmol/L)ECG 处理C666-1 细胞48 h 后，按照TUNEL 细胞凋亡试剂盒步骤进行染色.于荧光显微镜下检测荧光，调节激发波长450 ～500 nm，发射波长515 ～565 nm. 显微镜下细胞核呈亮绿色为TUNEL 反应阳性细胞.显微镜下随机计数10个高倍视野下阳性细胞所占百分数即为细胞凋亡率.

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

在6 孔板中，接种C666－1 细胞.给予不同浓度ECG(0、25、50、100 μmol/L)处理细胞48 h，弃培养基.收集细胞并计数，按照Annexin V/PI 双染流式细胞检测试剂盒说明书，染色后上机检测并定量分析细胞凋亡率.

1.6 Western Blotting 检测凋亡相关蛋白表达

在6 孔板中，以2 × 106/孔接种C666-1 细胞.经不同浓度ECG(0、25、50、100 μmol/L)处理48 h，弃培养基，加入2 ×SDS sample buffer 提取细胞总蛋白，依次进行SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜、封闭，加入待测一抗和内参β-actin 抗体，4 ℃孵育过夜，次日加入二抗(鼠源性一抗和兔源性一抗分别与相应鼠二抗及兔二抗匹配使用)，化学发光法检测目的蛋白表达情况，Image J 软件进行条带灰度分析.

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0 软件进行统计学分析，各组数据以均值±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P ＜0.05 表明差异具有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 ECG 浓度对人鼻咽癌C666-1 细胞株增殖的影响

采用CCK-8 检测试剂盒检测ECG 对细胞增殖的抑制作用.随着ECG 浓度增加，C666-1 细胞的增殖率逐渐降低，且表现出明显的剂量依赖关系(图1A). 100 μmol/L 的ECG 处理不同时间(0、6、12、24、48 h)发现，12 h 时细胞增殖已受到抑制，24 ～48 h时，增殖抑制作用随时间变化明显增加(图1B).

2.2 ECG 浓度对人鼻咽癌C666-1 细胞株凋亡的影响

在CCK-8 增殖实验的筛选结果的基础上，分别采用0、25、50、100 μmol/L 的ECG 处理C666-1 细胞48 h，分别使用TUNEL 法和流式细胞仪检测细胞凋亡，结果发现，25、50、100 μmol/L 的ECG 处理组的C666-1 细胞有明显的细胞凋亡，且呈剂量依赖性(图2).

2.3 ECG 对人鼻咽癌C666-1 细胞株Bax/bcl-2 蛋白表达的影响

图1 不同浓度ECG 对鼻咽癌细胞株C666-1 增殖的影响Figure 1 Effects of ECG concentration on proliferation in nasopharyngeal carcinoma cell line C666-1

图2 ECG 浓度对鼻咽癌C666-1 细胞株凋亡的影响Figure 2 Effects of ECG concentration on apoptosis in nasopharyngeal carcinoma cell line C666-1

不同浓度ECG(0、25、50、100 μmol/L)处理C666-1 细胞48 h 后，采用Western Blotting 检测C666-1 细胞Bax 和Bcl-2 蛋白表达水平，结果(图3)显示，随着ECG 浓度增加，Bax 蛋白表达稍有增加，Bcl-2 的蛋白表达显著下降，并且Bax/Bcl-2 的比值明显增加，表现出剂量依赖性.

图3 ECG 浓度对鼻咽癌C666-1 细胞株Bax/bcl-2 相对蛋白表达的影响Figure 3 Effect of ECG concentration on the protein expression of Bax/Bcl-2 in nasopharyngeal carcinoma cell line C666-1

2.4 ECG 对人鼻咽癌C666-1 细胞株Caspase 3 的影响

不同浓度ECG(0、25、50、100 μmol/L)处理C666-1 细胞48 h 后，采用Western Blotting 检测C666-1 细胞Caspase 3 蛋白表达水平，结果(图4)显示，ECG 可剂量依赖性地增加剪接的Caspase 3 蛋白表达水平.

3 讨论

图4 ECG 浓度对鼻咽癌C666-1 细胞株Caspase 3 蛋白表达的影响Figure 4 Effect of ECG concentration on the protein expression of Caspase 3 in nasopharyngeal carcinoma cell line C666-1

从植物(如绿茶)提取的茶多酚，主要含有4 种单体成分:表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、ECG 和表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG). 大量体内外实验研究证明茶多酚具有抗氧化、抑菌、心脑血管保护等多种作用［5］. 近年来研究发现，其单体成分具有更强的抗肿瘤活性［6－7］.ECG 是茶多酚的主要单体成分之一，研究表明ECG 可抑制雌激素受体依赖的乳腺癌细胞MCF-7 增殖，并延缓C57BL/6小鼠肿瘤组织的生长［8］.ECG 通过增加p53 和降低Bcl-2 的表达诱导肺癌细胞株NCI-H460 凋亡［9］.基质金属蛋白酶(MMPs)在肿瘤的转移和侵袭过程中发挥重要作用，ECG 可通过抑制MMP-2 和MMP-9的活性进而抑制人纤维肉瘤HT1080 细胞的侵袭和转移［10］.然而，迄今为止ECG 在人鼻咽癌细胞中的作用少有报道. 本实验结果发现ECG 能显著抑制C666-1 细胞生长，具有浓度依耐性和时间依赖性.由于诱导肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤的重要策略之一，而且大多数化疗药物都可以通过诱导细胞凋亡达到清除肿瘤细胞的作用.因此，本研究进一步探讨了ECG 对C666-1 细胞凋亡的影响，发现ECG 可剂量依赖性地诱导人鼻咽癌C666-1 细胞凋亡.以上结果提示ECG 可能具有潜在的治疗鼻咽癌的作用.

细胞凋亡的发生取决于促凋亡基因和抑凋亡基因的相对比值.Bcl-2 是目前发现的最重要的抑制肿瘤细胞凋亡的基因，自从1984年Bcl-2 基因在B 细胞淋巴瘤克隆以来，已有20 多个家族成员相继被发现［11］.Bax 是第一个被确定的Bcl-2 的同源基因，可拮抗Bcl-2 的保护效应而使细胞趋于凋亡. Bax 和Bcl-2 通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡.当Bax 形成同源二聚体时诱导细胞凋亡，Bax 与Bcl-2 形成异源二聚体时则实现了Bcl-2 抑制细胞凋亡的功能.早在1993年Korsmeyer［12］就提出Bax/Bcl-2 比率是调控细胞死亡的“可变电阻器”，在外界因素刺激下，细胞的生死最终取决于Bcl-2 和Bax 2 种调控因子的平衡结果.研究表明Bax/Bcl-2 的比值与细胞凋亡密切相关，并决定了促凋亡因子caspase-3 的激活程度［13－14］. 在本实验中，ECG 可降低Bcl-2 的蛋白水平增加Bax 的表达，并且剂量依赖性地增加Bax/Bcl-2 相对比值，进而诱导促凋亡因子caspase-3 的激活. 以上结果提示，Bax-Bcl-2-caspase 3 通路可能参与了ECG 诱导的人鼻咽癌C666-1 细胞凋亡过程.

综上所述，ECG 在时间和剂量依赖性地抑制人鼻咽癌C666-1 细胞增殖，并诱导C666-1 细胞凋亡，通过增加Bax/Bcl-2 比值激活caspase-3. 本研究首次证明ECG 可抑制人鼻咽癌细胞株C666-1 增殖并诱导其凋亡，为将ECG 应用于鼻咽癌临床实验提供必要的数据.

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