韦宏珍

广西武鸣县疾病预防控制中心　530199



食品中金黄色葡萄球菌检测方法的分类与进展

韦宏珍

广西武鸣县疾病预防控制中心530199

摘要金黄色葡萄球菌是人类一种重要的病原菌，是革兰氏阳性菌的代表，可引起人类食物中毒和许多严重感染，因此对于金黄色葡萄球菌的检测有重要意义，本文对其检测方法进行了分析，并对其研究的现代进展进行论述。

关键词金黄色葡萄球菌检测方法进展

金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus,S.aureus)是一种常见的病原微生物，它广泛分布在自然界，包括空气、水以及动物的排泄物中。S.aureus能分泌20多种毒性蛋白质，产生肠毒素、杀白细胞素等多种毒素以及多种酶类，容易引起人和动物化脓感染、人食物中毒。S.aureus会通过食品的加工、包装及运输过程污染食品，其分泌的毒素对热的抵抗力很强，加热煮沸30min仍能致病。在美国，由S.aureus引起的食物中毒占全部细菌性食物中毒的33%，加拿大更是占到了45%[1]，而在我国则有25%[2]。因此，S.aureus为我国食品安全国家标准食品微生物检验常规检测项目之一[3]。为加强食品中S.aureus的检测及食物中毒的预防和控制，本文对目前S.aureus检测方法的研究进展进行综述，旨在为从事S.aureus检验的工作人员提供科学的依据和指导。

1S.aureus传统检验法

食品中S.aureus的检验方法[3]：无菌取样25g(ml)，加入225ml 7.5%NaCl肉汤或胰蛋白胨肉汤中均质，制成10-1稀释液，将10-1稀释液(36±1)℃培养18～24h;将上述稀释液或培养液分别划线Baird-Parker平板和血平板，(36±1)℃分别培养18～48h、18～24h，挑取Baird-Parker平板上圆形颜色呈灰至黑色、周围有一浑浊带、外层有一透明圈和血平板上金黄色或白色、周围有溶血圈的菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。

2S.aureus快速检测法

2.1纸片法快速测试片是较常用的一种方法，用纸片、胶片、膜等作为培养基载体，添加特定的培养基和显色物质，通过观察微生物的生长、显色来测定食品中的微生物[4,5]。纸片测试的方法操作简单方便，便于运输携带方便，其缺点是耗时长、无法准确定性和计数。

2.2S.aureus显色培养基是一类利用微生物自身代谢产生的酶与相应显色底物反应而显色的新型培养基。通过将目标微生物特征性酶的显色底物加入到选择性培养基中，当目标微生物生长时，其特征性酶表达进而与底物反应并形成有颜色的代谢物，而干扰菌的生长受到抑制或不产生相应的酶，与底物不反应而不显色，因而根据菌落颜色进行辨别。该方法具有灵敏性、特异性和选择性。根据菌落颜色就可鉴定菌种，不需要补充试验[6~8]。目前常用于S.aureus显色培养基主要有培养基A、培养基B和PEN-TCF，其中A和PEN-TCF的回收率较高，而B抗干扰能力稍强[9]。

3免疫学方法

免疫学检测S.aureus的方法主要有:(1)乳胶凝集试验，通过使用含单克隆抗体的乳胶凝集试验可以简单、快捷鉴定S.aureus。新开发的Slidex staph.plus乳胶试剂，对于S.aureus的检测灵敏度较高，尤其对耐甲氧西林和甲氧西林敏感的S.aureus，检测仅需数分钟，是一种简便快速度的检测方法。(2)血浆凝固酶试验，S.aureus可以产生血浆凝固酶，将血浆中纤维蛋白变为不溶性纤维蛋白，生成凝块。血浆凝固酶试验可以判定菌株是否具有致病力，常用于鉴定S.aureus和其他葡萄球菌。

4分子生物学方法

4.1PCR法作为主要的分子生物学方法，1985年由Mullis等创立，不同于传统的培养检测方法，PCR法对活菌和受损菌以及死菌均可检测，是一种以变性、退火、延伸为基本步骤的体外外快速扩增特异目标基因的技术，也被称为基因的体外扩增法[10]。此方法具有迅速准确的优点，但仪器设备较昂贵，技术要求较高，对实验室条件要求较高，不适用于一般实验室。同时，普通PCR产物还会引起污染，增加假阳性结果，反应中添加的溴化乙锭具有较强的致癌性，会引起健康问题。

4.2荧光定量PCR法1996年，美国Applied Biosystems公司推出的新定量试验技术，使用荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合软件可对产物进行定量分析的方法。谢晓红等对于荧光定量法对食源性疾病的研究[11]，发现其灵敏度达4~8CFU/ml，是普通PCR灵敏度的10倍、常规培养的1 000倍，本方法具有操作简单快速、高特异和高灵敏的特点。

4.3环介导恒温扩增法其广泛应用于生命科学领域，主要包括病毒、细菌和真菌等检测[12~18]。根据靶目标序列上的特异区域设计引物，在恒温条件下，利用具有链置换活性的DNA聚合酶，通过形成环状结构及链置换，对目标DNA进行大量扩增并形成多种片段DNA产物的一种新型核酸扩增方法。该方法具有高效、特异、快速等特点。

5肠毒素检测

S.aureus病原性是由携带的肠毒素引起的。金黄色葡萄球菌其耐热性较差，在常规加热的情况下即可杀灭病菌，而肠毒素的耐热性较强。因此，国际上食品检验的法规中将肠毒素的检测纳入。根据检测原理分为三种：动物实验法、免疫血清学方法，核酶扩增法。

5.1动物实验法以幼猫为研究对象，在食物中毒患者的剩余食物、呕吐物或者粪便做细菌分离鉴定的同时，将其接种在肉汤培养基中，在6~8周龄的幼猫腹腔中注射孵育后取出的滤液，在注射4h后，出现呕吐、腹泻、体温升高或者死亡的情况，提示存在肠毒素的可能。其优点是观察结果准确、判定直观，缺点是动物的来源困难及灵敏度较差。

5.2免疫血清学方法在食品卫生检验中S.aureus肠毒素免疫血清学方法是一种以肠毒素为抗原，生产相应特异性抗体，通过结合性反应发生，形成可见沉淀为原理的检测方法。包括免疫琼脂扩散法、反向间接血凝试验法、反向被动乳胶凝集试验法、酶联免疫吸附法、放射免疫测定法、酶联免疫化学发光检测法等。酶联免疫吸附法是利用酶标记的抗原或抗体在固相载体上进行抗原或抗体的测定，具有高灵敏度、操作简便、反应迅速、无特殊设备的优点，目前已有商品化的试剂盒，其缺点是易引起交叉反应造成假阳性。

5.3核酶扩增法针对细菌的核酸而发展起来的基因分型检测方法，包括常规PCR法、荧光定量PCR法和LAMP技术。PCR法可诊断基因水平并大量样品进行检测，可直接应用于检测S.aureus的产毒基因。张严峻等[19]运用PCR方法检测从患者中分离的80株S.aureus，得到9株基因型，肠毒素携带率为85.0%，具有2种以上毒素基因的菌株占76.3%；食品中分离得到51株S.aureus，检测到7种基因型，肠毒素携带率为68.7%，具有2种以上毒素基因的菌株占21.6%。与传统培养或免疫学方法相比，PCR技术具有高敏感性、强特异性、高重复性、高自动化程度等特点，可提供快速、准确的病原学诊断，但也受到食品基质、培养基成分的干扰，残留食物成分也会影响PCR反应，死亡的S.aureus残留DNA易造成假阳性结果。荧光定量PCR技术在一定程度上克服PCR的不足和缺点，它实行封闭式操作、荧光标记探针具有更高的特异性、高通量与自动化使其操作简便、节省时间，且能处理大样本量筛查；其缺点主要是昂贵的仪器和试剂，对实验人员的操作能力要求较高，限制了大规模的应用。

6总结与展望

上述是检测S.aureus的常用方法。随着技术不断提高，常规细菌培养愈发成熟，已成为基层最常用的方法，但由于操作复杂、费时，不能做到早期快速诊断。免疫学方法因其灵敏性和特异性较低，目前还不为广泛接受。分子生物学方法虽然快速、敏感性和特异性高，但高检测费用也限制其在基层实验室广泛应用。将分子生物学技术和免疫学知识有效结合检测和预防S.aureus引起的食物中毒，并且对食源性疾病的检测和预防也有一定的帮助，随着社会的发展和现代化的迅猛变化，传统检测方式的适应性已经下降，对于快速检测方法的研究已成为现代化的需求，对于分子分型的建立，是未来检测方法的方向和趋势。

参考文献

[1]唐梦君，周生，葛庆联，等.应用LAMP快速检测金黄色葡萄球菌的研究〔J〕.现代食品科技，2011，27(6)：719-722.

[2]李梦歌. 金黄色葡萄球菌及其控制与检测〔J〕.食品安全导刊，2012，(1)：23.

[3]中华人民共和国卫生部.GB4789.10-2010. 食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验〔S〕.2010.

[4]岳国萍，刘新，崔海洋. 两种方法检测食品中金黄色葡萄球菌的结果分析〔J〕. 首都公共卫生，2009，3(1)：46-48.

[5]许如苏，林彩华，孙霞，等. 应用测试片快速检测食品中金黄色葡萄球菌的研究〔J〕. 食品研究与开发，2009，30(1)：94-97.

[6]张淑红，吴清平，张菊梅，等. 显色培养基在几种食源性致病菌快速检测中的应用〔J〕. 微生物学通报，2006，33(6)：108-111.

[7]刘钰，刘军，赵英杰. 金黄色葡萄球菌显色培养基在乳品检验中的应用〔J〕. 预防医学文献信息，2004，10(1)：87.

[8]黄汝添，吴清平，张菊梅，等. 金黄色葡萄球菌显色培养基研究进展〔J〕. 中国卫生检验杂志，2007，17(6)：1148-1150.

[9]黄汝添，吴清平，张菊梅，等. 三种金黄色葡萄球菌显色培养基检测效果的比较〔J〕. 微生物学通报，2009，36(8)：1105-1109.

[10]王蒋丽，李彩云，曾强，等. 荧光PCR法与细菌时间差法在食源性致病检测中的应用〔J〕. 中国卫生检验杂志，2001，21(10)：2498-2499.

[11]谢晓红，韩华忠，沈莉，等. 荧光定量PCR技术在食源性疾病病原菌快速检测上的应用与评估〔J〕. 中国卫生检验杂志，2011，21(12)：2890-2895.

[12]危月球，雷永良，陈秀英，等. 实时荧光定量PCR技术在常见呼吸道传染病检测中的应用〔J〕. 中国卫生检验杂志，2010，20(5)：1081-1082.

[13]ZHAO X,LI Y,WANG L,etal.Development and application of a loop-mediated isothermal amplification method on rapid detection Escherichia coli O157 strains from food samples〔J〕. Mol Biol Rep,2010,37(5):2183-2188.

[14]ZHAO X,LI Y,WANG L,etal.Development and application of a loop-mediated isothermal amplification method on rapid

中图分类号：TS201.6

文献标识码：A

文章编号：1001-7585(2015)11-1446-03