王 可，张久明，史振平，田 黎*

(1.青岛科技大学，青岛266042，2.国家海洋局第一海洋研究所，青岛 266061)

随着人们对环境保护重要性认识的日益加深，对低毒高效绿色农药的要求更为严格，同时，害虫的抗药性增加与新害虫的出现，也增加了农业生产对新农药的不断需求，与生物杀菌剂相比，高效低毒的杀虫剂的开发更为困难，农药创制最主要的研究内容是先导化合物的发现，而其作用机理也是农药研究的重要组成部分。海洋微生物作为新农药先导化合物发现的资源正逐渐受到重视，深海与极地是海洋环境的特殊生境，在此生境生活的微生物被认为更容易产生有用的代谢产物(李利君等，2000)。课题组从北冰洋深海区沉积物中分离获到一株链霉菌 Streptomyces nitrosporeus，并由其代谢产物中获得一种吲哚咔唑类生物碱，此类化合物多用于抗肿瘤药物研制，很少用于杀虫剂的研究(Sanchezl and Insuamm，2003;侯琦，2008;陈苏婷和尤启冬，2008)。本研究测试了吲哚咔唑类生物碱对菜青虫Pieris rapae、小菜蛾 Plutella xyllostella、甘蓝蚜 Brevicoryne brassicae 和美国白蛾Hyphantria cunea 等多种害虫的杀虫活性，并以菜青虫为靶标试虫，对此化合物的作用机理进行了初步探索。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及产生的吲哚咔唑生物碱

硝孢链霉菌Streptomyces nitrosporeus 菌株由课题组从北冰洋深海区沉积物中分离获得，其生境同时具备极地与深海的特性，采用海洋放线菌培养基培养12 d，发酵物经杀虫活性跟踪提取，获得吲哚咔唑生物碱，测试前先以1%的甲醇溶解成母液，再用蒸馏水配置成相应的测试浓度。

1.2 测试害虫及试验方法

菜青虫、甘蓝蚜、美国白蛾和小菜蛾均采自青岛科技大学生物农药试验基地甘蓝田，在温室内连续饲养3 代以上。饲养条件:温度25℃±1℃，RH60%-70%，光周期14L∶10D。选择个体发育一致的健康3 龄幼虫供试。

1.2.1 胃毒活性测定:采用浸叶饲喂法测定(徐向荣等，2006)。甘蓝叶蝶浸入0.08 mg/mL 药液5 s，取出晾干，放入垫有保湿滤纸的培养皿中，接入供试昆虫，每皿20 头虫，重复3 次，同样浓度甲醇处理为对照。48 h 后检查死亡虫数，计算校正死亡率。

1.2.2 触杀活性测定:采用微量点滴法测定(徐向荣等，2006)。将幼虫浸入0.08 mg/mL 药液7 s，滤纸吸去虫体多余药液，置装有干净滤纸与甘蓝叶的培养皿，每皿20 头，重复3 次，同样浓度甲醇处理为对照，48 h 后检查死亡虫数，计算校正死亡率。

1.2.3 生长发育测定方法:以不同浓度吲哚咔唑生物碱(0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.08 mg/mL)处理的甘蓝叶片饲喂菜青虫3 龄幼虫，试虫处理前饥饿5-6 h。每处理3个重复，每重复10 头幼虫，对照以溶剂处理饲喂，2 d 后换以新鲜无毒叶片继续饲喂。观察试虫生长发育情况，记录试虫蛹重和化蛹率，每24 h 称重1 次，记录试虫体重，并计算生长发育抑制率，计算公式如下:

1.2.4 酚氧化酶活性测定:(1)试虫处理方法:取菜青虫3 龄初期幼虫，饥饿5 h 后，分对照和处理两组各20 头待试。处理组试虫以0.04 mg/mL药剂浸渍的甘蓝叶片饲喂，对照组饲喂溶剂浸渍的叶片。分别取饲喂后24 h、48 h、72 h 的试虫待试。(2)将处理好的试虫经磷酸缓冲液清洗后整体置于预冷的匀浆器中，定量加入0.02 mol/L pH 6.5磷酸缓冲液。冰浴下匀浆，6000 r/min、4℃离心30 min。用移液枪吸取上清液为待测酶液。酶活性测定参考Benjamin and Montgomery 的方法(1973)。

1.2.5 纤维素酶活性测定:试虫处理方法同1.2.3。酶活性测定参照潘鲁青和王克行的方法(1997)。

1.2.6 几丁质酶活性测定:试虫处理方法同上。酶活性测定参照张少英方法(2005)。

1.2.7 酯酶活性测定:试虫处理方法同1.2.3。酶活性测定参照刘刚方法(2007)。

1.2.8 酶原蛋白含量测定:参考Bradford 考马斯亮蓝G-250 法(1976)。

2 结果与分析

2.1 吲哚咔唑生物碱对4种试虫的杀虫活性

吲哚咔唑生物碱对菜青虫、小菜蛾、甘蓝蚜和美国白蛾的活性结果见图1。由图1 可以看出，供试的4种试虫中，小菜蛾受到的影响最大，触杀和胃毒处理的校正死亡率分别达到了96.55%和86.21%，对菜青虫的触杀活性为89.66%、胃毒活性为81.04%，对美国白蛾的触杀活性为82.76%、胃毒活性为74.14%，对甘蓝蚜的触杀活性为79.31%、胃毒活性为60.35%。结果表明，哚咔唑生物碱对多种害虫同时具有很强的触杀和胃毒活性，触杀活性略高于胃毒。

图1 吲哚咔唑生物碱化合物4种试虫的杀虫活性Fig.1 Insecticidal activities of Indolocarbazole alkaloid to 4 kinds of insects

2.2 吲哚咔唑生物碱对菜青虫生长发育的影响

吲哚咔唑生物碱对菜青虫幼虫生长的抑制率如图2。0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.08 mg/mL不同浓度药剂处理后，第1 天不同浓度的药剂处理对试虫的生长影响与对照相比无显著性差异(P＞0.05)，之后抑制率开始升高，而且不同浓度对试虫的生长抑制作用存在极显著差异(P＜0.01)，3种浓度分别在处理后的第3 天、第2 天和第4 天达到最大，为12.95%、16.49%和33.47%。以上结果说明吲哚咔唑生物碱能对菜青虫的生长发育起到较好的抑制作用，而且随着药剂浓度的升高，最大抑制作用增强。

图2 吲哚咔唑生物碱对菜青虫的生长发育抑制率Fig.2 Inhibition ratio of Indolocarbazole alkaloid against Pieris rapae

吲哚咔唑生物碱对菜青虫蛹重和化蛹率的影响结果见表1。由表中数据可知，三组不同浓度的药剂处理的试虫中，0.08 mg/mL 药剂处理的试虫蛹重最低为31.8 mg，化蛹率仅为37.67%;0.02 mg/mL 处理的试虫蛹重和化蛹率最高，这表明吲哚咔唑生物碱对菜青虫蛹重的增加和化蛹率起到了较好的抑制作用，而且浓度越高抑制作用越明显。

表1 吲哚咔唑生物碱对菜青虫蛹重和化蛹率的影响Table 1 Inhibitory effect on weight of pupa and pupation rate of Indolocarbazole alkaloid against Pieris rapae

2.3 吲哚咔唑生物碱对菜青虫酚氧化酶活性的影响

菜青虫酚氧化酶活性受吲哚咔唑生物碱的影响结果见表2，处理24 h 之前，酚氧化酶活性几乎不受影响，随着时间的延长，对酶的抑制作用增强，到48 h 对照组酶活为1.2941 △OD/min·mg pr，处理组酶活仅为0.5974 △OD/min·mg pr，两者差异显著，活性抑制也达到最大。表2 显示处理24 h、48 h 和72 h 后，酶比活力分别表现为同期对照的0.73、0.46 和0.53 倍，表明吲哚咔唑生物碱对菜青虫酚氧化酶有明显的抑制作用。

表2 吲哚咔唑生物碱对菜青虫3 龄幼虫酶活的影响Table 2 Effect of Indolocarbazole alkaloid on enzyme activity in the 3rd instar larvae of Pieris rapae

2.4 吲哚咔唑生物碱对菜青虫纤维素酶活性的影响

由表2 可以看出，菜青虫纤维素酶活性受吲哚咔唑生物碱的影响，各时期酶活性大多低于相应对照的酶活性，48 h 对照组酶活性为0.7100 μg/min/mg，处理组酶活性仅为0.3710 μg/min/mg，即化合物处理试虫24 h、48 h 和72 h，酶比活力分别是同期对照的0.73、0.52 和1.07 倍，表现为先抑制后升高。

2.5 吲哚咔唑生物碱对菜青虫几丁质酶活性的影响

由表2 可知，经生物碱处理的菜青虫几丁质酶呈现在24 h 活性达到最大为1.3450 OD/mg pr，而对照组的酶活性为0.7820 OD/mg pr，处理是对照的1.72 倍，48 h 后处理组酶活开始下降，为同期对照的0.87 倍，但下降幅度不大，72 h 为0.85 倍。

2.6 吲哚咔唑生物碱对菜青虫酯酶活性的影响

处理菜青虫酯酶的活性开始高于对照组，随着处理时间的延长，酯酶活性逐渐升高，在72 h活性影响达到最大为1.7742 umol/ug pro/30min。处理组酯酶活性在24 h 和48 h 分别为同期对照的1.38 和1.49 倍，72 h 时活性达最高是同期对照组的2.59 倍。

3 结论与讨论

目前，海洋微生物代谢产物药用国内外研究报道较多，但用于农药研究尤其用于杀虫的研究报道很少，本研究由极地与深海两种生境兼有的链霉菌获得吲哚咔唑生物碱，经测试对菜青虫、小菜蛾、美国白蛾及甘蓝蚜等多种害虫同时具有较强的触杀、胃毒活性，展现出良好的杀虫潜力，而杀虫机理的探索对分析新农药发挥的作用及毒性分析具有重要的意义。

国内外对杀虫机理的研究主要集中在对试虫组织病理学的观察和各种酶的测试，其中酶在昆虫生长和对农药的反应中表现敏感，较容易测试，受到广泛关注(吕敏，2009)。酚氧化酶参与昆虫表皮的硬化、暗化，卵鞘的鞣化等作用，也是昆虫防御反应和免疫能力的重要指标;昆虫正常生长过程中，体壁外表皮的硬化形成外骨骼，阻碍了昆虫的生长，幼虫要周期性脱皮，才能继续进行生长发育，几丁质酶可调节昆虫的周期性蜕皮并合成新表皮，由于这两种酶与昆虫特有的生长发育过程有关，而高等动物没有这种生命过程，因此被认为研制对环境友好新型害虫生物调控剂的重要作用靶标(高兴祥，2004;刘伟，2010)。纤维素酶是昆虫体内的水解酶，与取食植物的昆虫体内消化系统密切相关;酯酶是昆虫体内的重要的解毒代谢酶，参与各种外源毒物的代谢，当昆虫取食非嗜食寄主植物后，可引起体内多种代谢酶活性的变化，以起到解毒作用。吲哚咔唑生物碱处理导致虫体酯酶活性增高，表明试虫对有毒物质产生应激反应，而酚氧化酶、几丁质酶、纤维素酶活性降低，显示影响昆虫对食物的消化吸收及正常的生长发育，在症状上也表现出试虫体变小，不能化蛹，进而死亡。综上，该吲哚咔唑生物碱杀虫活性强，作用机制也显示对害虫的特异性，值得做更进一步的研究。

References)

Benjamin ND，Montgomery MW.Polyphenol oxidase of royal ann cherries:purification and characterization［J］.Journal Food Science，1973，38:798-806.

Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72:248-254.

Chen ST，You QD.Anticancer activity of indolocarbazoles［J］.Progress in Chemistry，2008，20(2):368-374.［陈苏婷，尤启冬.哚咔唑类化合物及其衍生物的抗肿瘤活性［J］.化学进展，2008，20(2):368-374］

Gao XX，Luo WC，Yu TC，et al.The effects of benzoic acid compound series on PPO of Spodoptera exigua Hübner［J］.Chinese Journal of Pesticide Science，2004，6(1):26-30.［高兴祥，罗万春，于天丛，等.几种苯甲酸类化合物对甜菜夜蛾多酚氧化酶活性的影响［J］.农药药学报，2004，6(1):26-30］

Hou Q.Effect of staurosporine induced apoptosis of MCF7/GFP-Bax stable cell line on Bax translocation from cytosol into mitochondria［J］.Acta Pharmaceutica Sinica，2008，43(4):378-382.［侯琦.Staurosporine 诱导人乳腺癌MCF7/GFP-Bax 非受体依赖途径的细胞凋亡对Bax 自胞浆至线粒体转移定位的影响［J］.药学学报，2008，43(4):378-382］

Li LJ，Cai HN，Su WJ.Studies on bioactive substances from marine microorganisms.［J］Journal of Jimei University(NaturalScience)，2000，5(2):80-86.［李利君，蔡慧农，苏文金.海洋微生物生物活性物质的研究［J］.集美大学学报(自然科学版)，2000，5(2):80-86］

Liu G.Camptothecin Insecticidal-Activity and Mechanism to Plutella Xylostellal［D］.Lin'an:Zhejiang Forestry University.2007，17-19.［刘刚，喜树碱对小菜蛾的生物活性及作用机理研究［D］.临安:浙江林学院，2007，17-19］

Liu W，Xue CB，Zhang JJ，et al.Inhibitory effect of tannic acid on growth，development and phenoloxidase activity of Spodoptera exigua larva［J］.Journal of Plant Resources and Environment，2010，19(1):32-37.［刘伟，薛超彬，张静静，等.单宁酸对甜菜夜蛾幼虫生长发育及酚氧化酶活性的抑制作用［J］.植物资源与环境学报，2010，19(1):32-37］

Lv M.Preliminary Studies on the Insecticidal Activity and Action Mechanism of Fraxinellon［D］.Yangling:Northwest A ＆ F University，2009，28-30.［吕敏.梣酮的杀虫活性及作用机理的初步研究［D］.杨陵:西北农林科技大学，2009，28-30］

Pan LQ，Wang KX.The experimental studies on activities of digestive enzyme in the larvae Penaeus chinensis［J］.Journal of Fisheries of China，1997，21(1):26-31.［潘鲁青，王克行.中国对虾幼体消化酶活力的实验研究［J］.水产学报，1997，21(1):26-31］

Sanchezl J，Insuamm B.New cytotoxic indolic metabolites from a marine streptomyces［J］.Journal of Natural Products，2003，66(6):863-864.

Xu XR，Jiang HY，Zhang YN，et al.Bioactivity of Pharbitis purpurea extracts against Plutella xylostella［J］.Agrochemicals，2006，45(2):125-128.［徐向荣，蒋红云，张燕宁，等.牵牛子提取物对小菜蛾的生物活性［J］.农药，2006，45(2):125-128］

Zhang SY，Wang JB，Wang HF，et al.The relationship between activities of Chitinase and β-1，3-Glucanase and resistance to Rhizomania in sugar beet［J］.Acta Photophysiologica Sinica，2005，31(3):281-286.［张少英，王俊斌，王海凤，等.甜菜几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶活性与其对丛根病抗性的关系［J］.植物生理与分子生物学学报，2005，31(3):281-286］