吴成林 陈京萍 程菊芬 梁 朗 朱淑惠

（广州中医药大学门诊部，广州510405）

寿胎丸对去势大鼠骨组织内BMP和TGF-β表达的影响※

吴成林 陈京萍 程菊芬 梁 朗 朱淑惠

（广州中医药大学门诊部，广州510405）

目的观察寿胎丸对去势大鼠骨组织内骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）和转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的影响。方法40只雌性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、寿胎丸组和戊酸雌二醇组，行双侧卵巢切除术，寿胎丸组予寿胎丸13.4 g/kg/d灌胃，戊酸雌二醇组予补佳乐0.104 mg/kg/d灌胃，假手术组与模型组予等量生理盐水灌胃。于术后12周处死动物，切取大鼠股骨标本分别检测股骨近端骨组织形态学、骨组织中BMP和TGF-β含量及相关调控基因的表达。结果寿胎丸可明显改善卵巢切除所引起的骨组织微观结构的破坏。模型组骨组织中BMP2、BMP4和TGF-β含量明显低于假手术组（P＜0.05）；与模型组相比，寿胎丸组BMP2、BMP4和TGF-β，戊酸雌二醇组BMP2的含量均明显增加（P＜0.05）。同时，模型组骨组织中，BMP2、BMP4和TGF-β的基因表达明显降低（P＜0.05）；与模型组相比寿胎丸组BMP2、BMP4和TGF-β，戊酸雌二醇组BMP2相关调控基因的表达均明显增加（P＜0.05）。结论寿胎丸可明显改善卵巢切除引起的骨组织微观结构的破化，这可能与寿胎丸提高骨组织内BMP2、BMP4和TGF-β蛋白含量和相关调控基因的表达有关。

去势大鼠；寿胎丸；骨形态发生蛋白；转化生长因子-β；动物实验；天癸

随着社会老龄化的进程，骨质疏松性骨折的发生率呈逐渐上升趋势，全球范围约有超过2亿的女性患有骨质疏松症，其发生骨折的概率是男性的1.6倍，同时30%的绝经后女性患有骨质疏松，这些患者中的40%会发生一次或多次骨折，其所造成的医疗资源开支与癌症相似，甚或超过之［1］。因此，有效预防和治疗绝经后骨质疏松症已成为目前医学研究的重点之一。

BMP蛋白由成骨细胞合成和分泌，主要作用于骨基质，可通过刺激和诱导成骨细胞特异性转录因子Cbfa1的功能和表达，促进成骨细胞的分化［2］。目前对骨形成产生影响的BMP蛋白主要为BMP2、BMP4、BMP6和 BMP7。TGF-β可促进成骨细胞的增殖和分化，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化［3］。中医理论认为肾虚是骨质疏松的根本原因，故中医药治疗以“肾主骨”为理，以“补肾”为法。寿胎丸在天癸理论指导下，将“肾-冲任-天癸”生殖轴与“肾主骨生髓”相结合，在临床上用于治疗绝经后骨质疏松取得了良好的疗效，但其具体机制尚不清楚。我们的前期研究［4］证实，常规剂量的寿胎丸可有效治疗去势大鼠绝经后骨质疏松症，但具体的作用机制仍未阐明。因此，本实验通过建立绝经后大鼠骨质疏松模型，给予寿胎丸进行干预，并观察BMP和TGF-β的含量及相关调控的表达情况，探讨寿胎丸治疗绝经后骨质疏松症的具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组SPF级雌性SD大鼠（由广州中医药大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证：4405900000816），10～12周龄，体重180～230 g，共40只，随机分为4组，每组10只，分别为：A组，模型组；B组，假手术组；C组，寿胎丸组；D组，戊酸雌二醇组。

1.2 建立去势大鼠模型A、C、D组大鼠，采用浓度为3%的苯巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，75%酒精消毒，取下腹部正中切口，进入腹腔后探查并摘除双侧卵巢，结扎残端；术后3天予青霉素5万单位肌肉注射预防感染。术后第5天起，每天行阴道分泌物细胞学涂片检查，连续9天，涂片无周期性变化，提示去势彻底。B组大鼠，手术方法同上，仅切除双侧卵巢旁边一小块脂肪。

1.3 实验药物寿胎丸水煎剂制备：每剂含生药材共200 g，按菟丝子∶桑寄生∶续断∶阿胶=2∶1∶1∶1的比例，菟丝子、桑寄生、续断3味药加水750 ml，水提1次，煎至150 ml，阿胶烊化，四味药水煎液水浴浓缩至100 ml，浓度为2 g/ml（生药材）。戊酸雌二醇片：补佳乐，1mg/片，由拜耳医药保健有限公司广州分公司提供，将之溶于蒸馏水中，定溶为0.02 mg/ml备用。

1.4 给药方法于术后2周开始灌胃给药，以后每隔24小时给药1次，连续12周。A组和B组予生理盐水，按5 ml/（kg·d）剂量灌胃，连续10周；C组予寿胎丸水煎剂，按13.4 g/（kg·d）剂量灌胃，连续10周；D组予戊酸雌二醇，按0.104 mg/（kg·d）剂量灌胃，连续10周。1.5指标检测

1.5.1 大鼠骨组织形态学取大鼠左侧股骨全段，中间截断后置于10%中性福尔马林溶液中固定48 h，于Plank脱钙液中脱钙24 h，流水冲洗24 h，Leica TP1020全自动脱水机内进行脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，切片，切片厚度5 μm，Leica全自动染色机内进行HE染色。光学显微镜下放大100倍后观察骨组织形态。

1.5.2 大鼠骨组织BMP、TGF-β相关蛋白含量切取大鼠股骨近端骨组织标本，用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2～8℃的温度1h后加入液氮，充分研磨成粉末状，加入PBS（PH 7.4），离心20 min（3000转/分），仔细收集上清，采用ELISA试剂盒按照说明书上的操作步骤分别测量骨组织中BMP2、BMP4、BMP6、BMP7和TGF-β的含量。

1.5.3 大鼠骨组织BMP、TGF-β相关基因的表达采用RT-PCP检测BMP2、BMP4、BMP6、BMP7和TGF-β的表达。取大鼠新鲜股骨远端骨组织100 mg，液氮研磨后采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取总RNA，Thermo Multiskan GO全波长酶标仪配合Thermo μplate测定RNA浓度并分析纯度。使用Takara PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）进行逆转录反应。使用Takara SYBR®Premix Ex TaqTMII（Tli RNaseH Plus）在Biorad CFX96荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR反应，反应条件如下：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s延伸，40个循环，每个样本进行3次重复实验，实验所用引物见表1。

1.6 统计学方法采用SPSS 17.0软件包对实验数据进行统计分析，计量资料采用（x±s）表示，组间差异采用方差分析，检验水平为α=0.05，P＜0.05提示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨组织形态学如图1所示，模型组中大鼠卵巢切除后，相比于假手术组，骨小梁变细，部分断裂，连续性中断，骨小梁排列紊乱，间隙增大，说明骨组织的微观结构遭到了破坏。在药物干预组中，给予寿胎丸和戊酸雌二醇干预后，相较于假手术组，骨小梁增粗，无可见的断裂，排列规则，间隙减小，说明两种药物的干预可改善骨组织内微观结构的改变。

图1 各组大鼠股骨近端骨组织形态学比较（HE，×100）

2.2 骨组织内BMP和TGF-β的含量如表2所示，在模型组中，与假手术组相比较，骨组织内BMP2、BMP4和TGF-β的含量明显降低（P＜0.05），说明大鼠卵巢切除后，骨组织中成骨性蛋白的含量明显下降。给予药物干预后，在寿胎丸组中，与假手术组相比较，BMP2、BMP4和TGF-β的含量明显增加（P＜0.05）；在戊酸雌二醇组中，BMP2的含量较假手术组明显增加（P＜0.05）；同时，与戊酸雌二醇组相比，寿胎丸组中BMP4和TGF-β的含量明显增加（P＜0.05）。

表2 各组骨组织BMP蛋白和TGF-β蛋白的含量（x±s）

2.3 骨组织内BMP和TGF-β相关调控基因的表达如图2所示，在模型组中，与假手术组相比较，BMP2、BMP4和TGF-βmRNA的表达均明显降低（P＜0.05），说明，卵巢切除后骨形成的相关调控基因的表达明显下降。药物干预后，在寿胎丸组中，相比于模型组，BMP2、BMP4和TGF-βmRNA的表达明显上调；在戊酸雌二醇组中，相比于模型组BMP2的mRNA表达明显上调。与戊酸雌二醇组相比较，寿胎丸组中BMP4和TGF-β的表达明显增加。

图2 各组大鼠骨组织BMP和TGF-β相关调控基因表达的比较

3 讨论

在绝经后骨质疏松症中，骨组织的形成和修复过程由多种机制参与。其中，骨形态发生蛋白（bone morpho-genetic proteins，BMPs）与诱导成骨关系最为密切，是正常胚胎时期骨形成和成年骨修复中最主要的生长因子［5］。作为一种高效骨诱导物质，BMPs是间充质细胞向骨细胞系转化的最初信号分子，它启动间充质细胞向骨细胞分化。骨形成过程中BMP-Smad信号通路是最重要的细胞信号通路之一［6］，目前研究及应用最多的是BMP2、4、6、7。参与BMP信号传导的受体是一种跨膜糖蛋白，主要是I型受体和Ⅱ型受体。BMP通过与Ⅱ型受体结合形成复合物，Ⅱ型受体发生自身磷酸化而活化，并迅速与I型受体结合形成三元复合物。此时，在活化的Ⅱ型受体激酶作用下，I型受体磷酸化而被激活，随后I型受体激酶会激活信号传导分子R-Smads（包括Smad-1、Smad-3、Smad-5、Smad-8），使R-Smads磷酸化。具有活性的磷酸化RSmads与一种普通调节信号分子Smads-4结合后，信号传导至细胞核内，共同作用于靶基因而转录、翻译表达相应蛋白［7］。

TGF-β在骨组织重建过程中，具有重要作用。在成骨细胞中，TGF-β可促进成骨细胞增殖，并促进成骨细胞分泌Ⅰ型胶原［8］。同时TGF-β可诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化［9］。TGF-β还可作用于破骨细胞，介导破骨细胞的凋亡，进而抑制破骨细胞的骨吸收作用［10］。实验研究显示［11-12］，大鼠卵巢切除后，骨组织中TGF-β含量明显降低，给予TGF-β局部注射后可明显增加骨形成作用。

采用大鼠双侧卵巢切除术，构建了大鼠绝经后骨质疏松症模型。研究结果显示，去势后大鼠骨组织微观结构发生了明显破坏，同时骨组织内BMP2、BMP4和TGF-β含量明显下降，并伴随着BMP2、BMP4和TGF-β基因表达的下调。这说明BMP2、BMP4和TGF-β很可能参与了绝经后骨质疏松症的发病过程。在我们给予寿胎丸干预后，骨组织微观结构得到明显改善，同时BMP2、BMP4和TGF-β在蛋白及基因水平的表达明显上调。因此，我们推论，寿胎丸可通过上调骨组织中BMP2、BMP4和TGF-β的表达水平治疗绝经后骨质疏松症。

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Effects of Shoutai Pill on Expression of BMP and TGF-β in Bone Tissue of Ovariectomized Rat

WU Chenglin，CHENJingping，CHENGJufen，LIANGLang，ZHU Shuhui
（Out-patient department，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou510405，China）

Objective To observe effects of Shoutai pill on expression of BMP and TGF-β in ovariectomized rat.Methods Totally 40 female healthy SD rats were divided into sham group，ovariectomized group，Shoutai pill group and Progynova group.The bilateral oophorectomy was conducted.The rats in Showtai pill group were intervened by Shoutai pill with the dosages 13.4 g/kg/d and the rats in Progynova group were intervened by Progynova with the dosage of 0.104 mg/kg/d.In Sham group and ovariectomized group，equal quantity saline were intragastric administration.The rats were executed at 12 weeks after the operation，the histomorphology changes of bone were observed with HE stain，the content of BMP2，BMP4，BMP6，BMP7，TGF-β and the related regulating gene were detected.Results The application of Showtai pill could significantly ameliorate the microstructure changes of bone tissue.In bone tissues of ovariectomized group，the content of BMP2，BMP4 and TGF-β were significantly decreased than that those of the sham group（P＜0.05）.Comparing with ovariectomized group，the content of BMP2，BMP4 and TGF-β，and BMP2 in Progynova group were significantly increased（P＜0.05）. Meanwhile，comparing with the sham group，the mRNA expression of BMP2，BMP4 and TGF-β in the ovariectomized group were significantly decreased（P＜0.05）.Comparing with the ovariectomized group，the mRNA expression of BMP2，BMP4 and TGF-βin of the Shoutai pill group and BMP2 in the Progynova group were significantly increased（P＜0.05）.Conclusion The application of Showtai pill could significantly ameliorate the microstructure changes of bone tissue.This effect was likely be caused by increasing the content of BMP2，BMP4，TGF-β and the related mRNA expression.

ovariectomized rat；Showtai pill；bone morphogenetic protein；transforming growth factor-β；animal experiment；tian gui

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.14.069

1672-2779（2015）-14-0133-03

：杨杰本文校对：黄进

2015-06-11）

广东省中医药局科研课题（No：20132119）；教育部高等学校博士点基金（No：20114425120016）