席素雅 刘建强 陈树珍 张玲 王少颖

（1.河北省胸科医院呼吸科；2.河北省老年病医院，河北 石家庄 050000）

支气管哮喘（哮喘）是一种以气道阻塞、气道炎症和气道高反应为特征的炎症性疾病，呈家族聚集性，其发病涉及了遗传、环境、免疫、神经等因素［1］。多项研究［2－3］表明，白细胞介素13（IL－13）基因多态性与哮喘的发病密切相关。本研究以河北地区汉族人群为研究对象，采用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（PCR－RFLP）方法，分析该地区正常人群和哮喘患者IL－13基因＋2044G／A 的基因型和等位基因频率分布情况，以探讨该基因多态性与河北地区汉族人群哮喘的相关性，为哮喘患者的早期预防、早期治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 哮喘组：选择2011年7月至2013年7月河北省胸科医院收治的哮喘患者100例，均符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组2013年制定的《支气管哮喘防治指南》标准［4］，其中男48例，女52例，年龄20～65岁。对照组：同期选择我院体检中心健康体检者100例，男50例，女50例，年龄18～66岁，该组人群均无哮喘病史。两组人群年龄、性别差异无统计学意义。研究对象均为无血缘关系的我国北方汉族人，除外罹患严重全身感染、肿瘤、心脏病及肝、肾疾病等系统性疾病。全部入选对象均提前征得患者同意并填写知情同意书。

1.2 方法（1）基因组DNA 提取：取外周血3mL，加入含1.5mg／mL乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）的抗凝管中，摇匀，常规酚－氯仿法抽提基因组DNA，－20 ℃冰箱储存备用。PCR－RFLP检测基因型：聚合酶链反应扩增基因组DNA。参照文献［5］，IL－13基因＋2044G／A 位点引物序列如下：上游：5′－CTTCCGTGAGGACTGAATGAGACGGTC－3′，下 游：5′－GCAAATAATGATGCTTTCGAAGTTTCAGTGGA－3′。25μL PCR反应体系中含：10×缓冲液2.5μL；4×脱氧三组磷组酸组核组苷（dNTP，10 mmol／L）2.0μL；MgCl2（25mmol／L）2.5组μL，10组μmol／L组引组物组各1.0μL，模板DNA（10μmol／L）3.0μL；rTaq DNA聚合酶（5U／L）0.25μL，去离子水加至25μL。扩增反应在热循环仪上完成。循环参数为：95 ℃预变性10min；94℃变性30s，56 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，共35个循环；72 ℃最后延伸5min。PCR 扩增产物用限制性内切酶Pst I于37 ℃水浴消化8h，再在3%琼脂糖凝胶上加溴化乙锭（终浓度为0.7μg／mL），取8μL酶切产物在凝胶上上样电泳，紫外线灯照射下观察拍照。（2）测序：PCR 产物纯化并送上海生物工程有限公司进行测序。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件。研究资料的可靠性通过Hardy－Weinberg平衡检验检测，基因型和等位基因频率通过基因计数法计算。单个基因型及组间等位基因频率比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 IL－13基因型分析 IL－13基因＋2044G／A 多态性位点PCR 扩增产物大小为236bp，其上游引物设计的错配碱基G 使该位点扩增产物均存在一个NIaIV 酶切位点，均会被切下一26bp产物。经酶切后，电泳结果可见3种基因型：GG 型（含酶切位点的纯合子，酶切产物为178bp、32bp及26bp）；AA 型（不含酶切位点的纯合子，酶切产物为210bp和26bp）；GA 杂合子型（杂合子，酶切产物为210bp、178bp、32bp和26bp）。酶切结果见图1，由于32bp和26bp分子量较小，电泳时均已出胶。随机选取3 种基因型样本的PCR 产物进行测序，其结果与PCR－RFLP结果完全一致。

图1 IL－13基因＋2044G／A 多态性PCR 产物NIaIV 酶切电泳结果

2.2 两组IL－13基因＋2044G／A 基因型和等位基因分布频率比较（1）经Hardy－Weinberg 平衡检验，两组基因型符合遗传平衡，具有群体代表性。见表1。（2）IL－13＋2044G／A 位点基因多态性分布特点：IL－13基因＋2044G／A组多态性有3组种基因型，GG组型、AA组型、GA组型，两组组人组群组中组均组以GG组型组为主，GA 型次之，AA 型最少。分析显示：哮喘组IL－13＋2044G／A 位点基因型分布与正常对照组有差异（χ2=7.71，P＜0.05）。A 等位基因携带者（GA＋AA 基因型）在哮喘组（49例，49.0%）明显高于对照组（30例，30.0%）（χ2=7.55，P＜0.01），差异有统计学意义。见表2。

表1 IL－13基因＋2044G／A 位点基因型分布的Hardy－Weinberg平衡检验（%）

表2 IL－13基因外显子＋2044G／A 多态性基因型和等位基因频率分布比较［n（%）］

3 讨论

支气管哮喘是由免疫球蛋白E（IgE）介导的Ⅰ型变态反应性疾病，其发生过程中有多种细胞因子参与。IL－13是一种主要由活化的CD4＋Th2细胞分泌的多效能细胞因子，具有多种生物学功能，通过提高B细胞的活性、刺激B 细胞的增殖和诱导IgE的合成，从而导致气道反应性增高以及小气道结构重建，参与哮喘炎症的发生与维持［6］。

人IL－13（hIL－13）基因序列长度为4.6kb，含有4个外显子和3 个内含子。编码hIL－13的基因定位于5q31，分子量约12KD，是由132个氨基酸组成的非糖基化蛋白。近年国内外多项研究［7－11］及Meta分组析［12－14］显组示，IL－13基组因A2044G组单核组苷组酸多态性与哮喘发病密切相关，是哮喘发病的独立危险因素。文献［7－11］研究发现，＋2044G／AA 等位基因与哮喘的发病密切相关。而华丽等［15］研究发现，G 等位基因可能是哮喘的易感基因。

本研究以河北地区汉族人群为研究对象，分析了100例哮喘患者和100例健康人群的IL－13 ＋2044G／A 基因型和等位基因分布频率。结果显示，中国北方汉族人群IL－13 基因＋2044G／A 位点存在G→A 突变，且该基因型已达到遗传平衡，具有群体代表性。哮喘组AA 型和A 等位基因频率明显高于对照组，A 等位基因频率在哮喘组（29.5%）明显高于对照组（17.5%），差异有统计学意义，表明A等位基因可能是河北地区哮喘发病的易感基因。

研究发现，IL－13基因第4外显子的2044位碱基存在G→A 突变，从而导致编码的相应蛋白质的多态链第130位氨基酸由精氨酸（Arg）转变为谷氨酰胺（Gln），Gln 可能促进受体与IL－13 结合，由于空间结构的改变使IL－13 信号传导途径JAKSTAT6异常，从而影响IL－13的生物学活性。因此在碱基改变的结构基础上，进一步从蛋白功能角度研究这一改变对IL－13 转录及表达的影响，将对哮喘疾病的诊断和治疗有重要意义。

［1］Vercelli D.Genetics and biology of asthma 2010：La’ci darem la mano…［J］.J Allergy Clin immunol，2010，125（2）：347－348.

［2］Park HW，Lee JE，Kim SH，et al.Genetic variation of ILl3as a risk factor of reduced lung function in children and adolescents：A cross－sectional populationbased study in Korea［J］.Respir Med，2009，103（2）：284－288.

［3］Kim HB，Kang MJ，Lee SY，et al.Combined effect of tumour necrosis factor－alpha and interleukin－13polymorphisms on bronchial hyperresponsiveness in Korean children with asthma［J］.Clin Exp Allergy，2008，38（5）：774－780.

［4］中华医学会呼吸病学分会哮喘学组，中华医学会全科医学分会.中国支气管哮喘防治指南：基层版［S］.中国实用内科杂志，2013，36（5）：331－336.

［5］Graves PE，Kabesch M，Halonen M，et al.A cluster of seven tightly linked polymorphisms in the IL－13 gene is associated with total serum IgE levels in three populations of white children［J］.J Allergy Clin Immunol，2000，105（3）：506－513.

［6］Giuberqia V，Gravina LP，Castanos C，et al.Influence of beta2－adrenoceptor polymorphisms on the response to chronic use of albuterol in asthmatic children［J］.Pediatr Pulmonol，2008，43（5）：421－425.

［7］魏明，佘红纯，李素娟.白细胞介素IL－13基因多态性与哮喘易感的关系［J］.中国临床医学，2007，14（3）：329－330.

［8］舒磊.IL－13基因多态性位点rs20541和rs1800925单核苷酸多态性与儿童支气管哮喘关联性的研究［J］.浙江中西医结合杂志，2012，22（4）：254－255.

［9］冯丹.哮喘患者及其一级亲属IL－13基因多态性的研究［J］.黑龙江医学，2009，33（7）：481－482.

［10］丁宝栋，管立学，李海波，等.IL－13＋2044GA 多态性与儿童支气管哮喘关联性研究［J］.潍坊医学院学报，2013，35（5）：331－333.

［11］Liu Q，Hua L，Fang D，et al.Interleukin－13and RANTES polymorphisms in relation to asthma in children of Chinese Han nationality［J］.Asian Pac J Allergy Immunol，2013，31（3）：247－252.

［12］Li X，Zhang Y，Zhang J，et al.Asthma susceptible genes in Chinese population：a meta－analysis［J］.Respir Res，2010，11：129.

［13］Yang H，Dong H，Dai Y，et al.Association of interleukin－13 C－1112T and G ＋2044A polymorphisms with asthma：a meta－analysis［J］.Respirology，2011，16（7）：1127－1135.

［14］Nie W，Liu Y，Bian J，et al.Effects of polymorphisms－1112C／T and ＋2044A／G in interleukin－13 gene on asthma risk：a meta－analysis［J］.PLoS One，2013，8（2）：56－65.

［15］华丽，鲍一笑，吕婕，等.IL－13基因和β2－AR 基因单核苷酸多态性与儿童哮喘的关系［J］.临床儿科杂志，2008，26（1）：30－32.