王振伟，王振强

（黄河水利职业技术学院，河南开封475000）

甲壳低聚糖制备及其抗氧化活性研究

王振伟，王振强

（黄河水利职业技术学院，河南开封475000）

甲壳低聚糖是壳聚糖降解后的产物，其与壳聚糖相比分子量更小，水溶性更好，生物利用度更高。采用超声波协同α-淀粉酶处理壳聚糖制备甲壳低聚糖，以还原糖含量作为产品制备收得率的指标，通过正交实验优化制备工艺。结果表明，最佳工艺条件为：酶浓度1 000 U/g、酶解温度55℃、反应时间50 min、pH 5.2。在该条件下获得的降解产物还原糖浓度为2.25 mg/mL，制备效果优于单独超声波和酶解降解方法。对此方法制备的甲壳低聚糖的体外抗氧化活性进行研究，与抗坏血酸对比，其对DPPH自由基和超氧阴离子（O2-·）均有较强的清除能力。

甲壳低聚糖；超声波；α-淀粉酶；抗氧化活性

壳聚糖是天然含氮多糖类生物活性物质，在食品、化妆品、医药等领域有广泛用途。大量研究表明，壳聚糖的生理活性、功能性质与分子量密切相关，不同分子量的壳聚糖性质差异很大，而其许多功能要在分子量很小时才能体现出来。甲壳低聚糖是壳聚糖降解后的衍生物，与壳聚糖相比，具有分子量小、水溶性好、生物利用度高等独特活性［1］。目前，甲壳低聚糖的制备方法主要有物理法、化学法和生物法三大类。物理法包括超声波法、微波法和γ射线法等，具有无污染、反应易控、产品品质高等优点，但目前多处于研究阶段。化学法虽然已用于工业化生产，但此法降解所得的产品聚合度分布范围较宽，难以分离纯化，并会对环境造成污染；生物法在酶解过程中，不需加入其他反应试剂，无其他副反应，酶解过程易于控制，对环境无污染，优于化学制备过程［2］。

实验通过超声波协同酶解技术来研究壳聚糖的降解，制备得到功能性甲壳低聚糖。通过摸索研究超声波协同淀粉酶酶解条件对壳聚糖降解效果的影响，进行工艺技术的优化，从而达到高效降解壳聚糖的目的。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

壳聚糖：优级纯，脱乙酰度，80%～95%，北京中生瑞泰科技有限公司；淀粉酶：生物试剂，3 700 U/g，北京奥博星生物技术有限公司，其它试剂均为分析纯。

TU-1810紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；超声波清洗器：江苏昆山超声仪器有限公司；HC-3018R冷冻离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司。

1.2 方法

1.2.1 甲壳低聚糖制备

准确称取一定量的壳聚糖，溶于0.2 mol/L不同pH的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，浓度为2 g/100 mL，搅拌均匀形成均一胶体后，加入与壳聚糖不同比例的α-淀粉酶，分别在不同超声波功率、不同温度下反应一定时间，温度提高至90℃灭酶活，离心取上清液，测定还原糖含量（甲壳低聚糖产率计算依据）［3-4］。

1.2.2 还原糖含量测定

采用DNS法测定样品中还原糖浓度［5］。取待测样品1.5 mL，置于沸水浴中煮沸2 min，加入2 mL的DNS试剂，以流水迅速冷却，用水定容至25 mL，摇匀。以试剂空白调零，在540 nm处测定吸光度值，与盐酸氨基葡萄糖标准做对照，即可计算出样品中还原糖的含量（mg/mL）。

1.2.3 抗氧化活性检测

1）清除超氧阴离子（O2-·）的能力检测［6］

采用邻苯三酚自氧化法测定。首先向装有4.0 mL Tris-HCl缓冲溶液（50 mmol/L，pH8.2）的试管中，分别加入5 mL蒸馏水或一定浓度的甲壳低聚糖溶液，混匀后于25℃水浴30 min，取出后加入25℃水浴预热过的3 mmol/L邻苯三酚0.5 mL，迅速振荡混匀，于波长322 nm处每隔30 s记录一次吸光值。计算线形范围内每30 s吸光值的增加速率。

式中：ΔA0/Δt表示未加入甲壳低聚糖样品邻苯三酚自氧化的反应速率；Δi/Δt表示加入甲壳低聚糖样品后的反应速率。

2）清除DPPH自由基能力检测［7］

取2 mL DHHP溶液，加入2 mL同一溶剂溶解的甲壳低聚糖，充分混合。室温放置30 min后在517 nm处测定吸光度。DPPH自由基的清除率计算方法为：

式中：Ai为样品液2 mL和DPPH溶液（2× 10-4mol/L）2 mL测定的吸光度；Ae为溶剂2 mL和DPPH溶液2 mL测定的吸光度；Aj为样品液2 mL和溶剂2 mL测定的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 单因素条件确定

2.1.1 反应体系pH对壳聚糖酶解的影响

调整反应体系的pH分别为4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4和5.6，固定酶浓度为1 000 U/g，超声功率100 W，反应时间50 min，反应温度50℃，研究pH对淀粉酶酶解壳聚糖的效果，结果如图1所示。

图1 pH对甲壳低聚糖制备的影响Fig.1 Effects of pH value on yields of chito-oligosaccharides

从图1中可以看出反应体系pH对酶解效果有显著影响。酶解产物中还原糖浓度随着pH的上升呈现先上升后下降的趋势，pH在5.0左右的范围内，可以达到较好的酶解效果。该α-淀粉酶的适用pH范围为5.0～7.0，图中可看出在超声波协同下，该酶作用壳聚糖的最适pH为5.0。

2.1.2 酶浓度影对壳聚糖酶解效果的影响

所用α-淀粉酶酶活为3 700 U/g，研究酶与底物之间的比例（E/S）对甲壳低聚糖产率的影响，底物浓度固定为2 g/100 mL，改变α-淀粉酶用量，分别为200、400、600、800、1 000、1 200 U/g和1400 U/g，超声功率100 W，反应温度50℃，反应时间50 min，反应体系pH 5.2，研究酶浓度对壳聚糖降解的影响，结果如图2所示。

从图2中可以看出，随着α-淀粉酶浓度的上升，还原糖含量不断升高。当酶浓度大于1 000 U/g后，还原糖含量又稍微下降。酶浓度对壳聚糖的降解效果有一定的影响，在酶浓度达到饱和浓度之前，酶解效果随着酶浓度的升高而增强，而当酶与底物的结合接近饱和时，酶解效果则不再明显提高。

2.1.3 温度对壳聚糖酶解效果的影响

酶浓度固定为1 000 U/g，超声功率100 W，反应时间50 min，反应体系pH 5.2，改变反应温度分别为45、50、455、60、65、70℃，研究反应温度对壳聚糖降解的影响，结果如图3所示。

图2 酶浓度对甲壳低聚糖制备的影响Fig.2 Effects of amylase addition on yields of chitooligosaccharides

图3 超声酶解温度对甲壳低聚糖制备的影响Fig.3 Effects of enzymolysis temperature on yields of chitooligosaccharides

从图3中可以看出，酶解产物中还原糖浓度随着温度的上升呈现先上升后下降的趋势，温度在55℃左右的范围内，可以达到较好的降解效果。该α-淀粉酶的适用温度范围为50℃～70℃，从图可看出在超声波协同下，该酶作用壳聚糖的最适温度为55℃。可能是开始时随着温度升高能使反应物的能量增加，分子间碰撞的频率也增加，从而提高酶解速率，但是当温度过高，超过了酶的最适温度时，酶活性将降低，导致水解速度下降。

2.1.4 超声酶解时间对壳聚糖酶解效果影响

酶浓度固定为1 000 U/g，超声功率100 W，反应时温度50℃，反应体系pH 5.2，控制酶解的时间分别为10、20、30、40、50、60、70、80、90 min，研究反应时间对壳聚糖降解的影响，结果如图4所示。

从图4可以看出，随着降解的不断进行还原糖含量不断上升，超声酶解前30 min，还原糖含量上升的速度较快，60 min时还原糖浓度升到2.01 mg/mL，随后还原糖浓度变化平缓，且有下降趋势。说明随着时间的延长，超声波协同α-淀粉酶降解壳聚糖的反应持续进行，只是达到一定时间后，反应速率逐渐减慢。

2.1.5 超声波功率对壳聚糖酶解效果的影响

图4 超声酶解时间对甲壳低聚糖制备的影响Fig.4 Effects of enzymolysis time under ultrasonic wave on yields of chito-oligosaccharides

酶浓度固定为1 000 U/g，，反应时温度50℃，反应体系pH 5.2，控制酶解时间为50 min，改变超声波功率为20、40、60、80、100、120、140 W，研究超声功率对壳聚糖降解效果的影响，结果如图5所示。

图5 超声波功率对甲壳低聚糖制备的影响Fig.5 Effects of ultrasonic power on yields of chitooligosaccharides

从图5可知，超声功率从小变大，还原糖含量不断上升，说明超声波对α-淀粉酶的酶活在一定范围内具有促进作用，在超声功率为100 W时，还原糖浓度升到最大。随后还原糖浓度开始降低，酶活呈下降趋势，这是由于酶的酶学活性依赖于酶分子的构象结构，而超声波的空化作用改变了α-淀粉酶酶分子的构象，影响酶的酶学活性。由此本实验条件下最佳超声功率为100 W。

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，超声功率能够提升淀粉酶活性，功率100 W时达到最大，因此选择超声功率为100 W。同时甲壳低聚糖产率还受超声时间、酶解温度、酶浓度、pH4个因素交叉影响。选择此四个因素为考察因素，各取3个水平，进行L9（34）正交试验设计，不考虑各因素间的相互影响。超声波协同淀粉酶降解壳聚糖的因素水平设计见表1。

超声波协同淀粉酶降解条件的正交试验结果见表2所示。

从表中可以看出，在9个实验设计组中，第4组的降解效果最好，酶解产物中的还原糖浓度最高，达2.23 mg/mL。由极差分析可知，影响酶解效果的因素主次为：A＞D＞C＞B，即：酶浓度＞pH＞反应时间＞温度。超声波协同淀粉酶降解壳聚糖制备甲壳低聚糖的最优工艺组合为A2B2C2D3，即酶浓度1 000 U/g、酶解温度55℃、反应时间50 min、pH5.2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 L9（34）正交试验Table 2 Results of L9（34）orthogonal test

2.3 产率比较

分别采用超声波降解（功率100 W，时间50 min，温度55℃，体系pH 5.2），α-淀粉酶降解（酶浓度1 000 U/g，时间50 min，温度55℃，体系pH5.2），超声波协同α-淀粉酶（超声功率100 W，酶浓度1 000 U/g，酶解温度55℃，反应时间50 min，pH5.2）制备甲壳低聚糖，每种方法制备均做3次平行试验取平均值，对不同方式制备甲壳低聚糖的效果进行比较。

由表3结果可知，超声波协同复合酶制备甲壳低聚糖，与单纯超声波法和酶法降解相比，有较高的产率，同时采用超声波协同酶法制备甲壳低聚糖，能够大大节省单纯酶解的时间，因此有着明显的优势。

2.4 抗氧化活性结果分析

2.4.1 清除超氧阴离子（O2-·）能力

清除超氧阴离子（O2-·）能力见图6。

表3 不同制备方法还原糖含量比较Table 3 Comparison of yields of chito-oligosaccharides obtained by different methods

图6 超氧阴离子（O2-·）清除能力比较Fig.6 Comparison of scavenging superoxide capacity of chitooligosaccharides and ascorbic acid

从图6可以看出，甲壳低聚糖具备清除超氧阴离子的能力，且随着浓度的增加，对超氧阴离子的清除率迅速提升，当浓度达到1.2 mg/mL时，对超氧阴离子的清除率接近80%，当甲壳低聚糖浓度升到1.6 mg/mL时，对超氧阴离子的清除率能接近100%。与VC清除超氧阴离子的能力相比，VC的抗氧化能力更强。但超氧阴离子自由基能与甲壳低聚糖分子中的氨基和羟基反应而被清除，因此甲壳低聚糖对自由基的清除作用可能更为稳定和彻底。

2.4.2 清除DPPH自由基能力

清除DPPH自由基能力见图7。

图7 清除DPPH自由基能力比较Fig.7 Comparison of scavenging DPPH capacity of chitooligosaccharides and ascorbic acid

将制备的甲壳低聚糖配制成 0.05、0.04、0.03、0.02、0.01、0.008、0.006、0.004、0.002、0.001 mg/mL的溶液，配制同样浓度的抗坏血酸溶液，进行清除DPPH自由基能力检测。图7可知，甲壳低聚糖和抗坏血酸浓度分别达到0.02、0.04 mg/mL时，清除率达到90%，之后增长缓慢。超声协同酶法制备的甲壳低聚糖与抗坏血酸相比，有较强的清除DPPH自由基能力。

3 结论

1）超声波能够提升淀粉酶的活性，超声波协同α-淀粉酶，能够有效降解壳聚糖制备甲壳低聚糖。正交实验结果分析可知，影响降解效果的因素主次为：酶浓度＞pH＞反应时间＞温度。最优工艺组合为：酶浓度1 000 U/g、酶解温度55℃、反应时间50 min、pH5.2。

2）分别采用超声波降解，α-淀粉酶降解，超声波协同α-淀粉酶降解等3种方法制备甲壳低聚糖，对制备效果进行比较，结果表明超声波协同复合酶制备甲壳低聚糖，与单纯超声波法和酶法降解相比，有较高的产率，同时采用超声波协同酶法制备甲壳低聚糖，能够大大节省单纯酶解的时间，因此有着明显的优势。

3）研究超声波协同酶法制备的甲壳低聚糖的体外抗氧化活性，与抗坏血酸相比，对DPPH自由基和超氧阴离子（O2-·）均有较强的清除能力。超氧阴离子自由基是一种两性离子自由基，能与甲壳低聚糖分子中的氨基和羟基反应，清除作用可能更为稳定和彻底。

［1］赵光远，李娜.甲壳低聚糖的分离纯化和分析研究进展［J］.食品工程，2006（3）：36-38

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［3］Lin S B，Lin Y C，Chen H H.Low molecular weight chitosan prepared with the aid of cellulase，lysozyme and chitinase：characteri-sation and antibacterial activity［J］.Food Chem，2009，116（1）：47-53

［4］毛新，赵力超，刘晓娟，等.非专一性酶酶解壳聚糖的最佳工艺研究［J］.现代食品科技，2010，26（4）：392-395

［5］刘长春.生物产品分析检验技术［M］.北京：科学出版社，2009

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Study on Preparation of Chito-oligosaccharides and Its Antioxidant Activity

WANG Zhen-wei，WANG Zhen-qiang
（Yellow River Conservancy Technical Institute，Kaifeng 475000，Henan，China）

Chito-oligosaccharides is the degradation product of Chitosan，which has small molecular weight，good water-soluble and a higher oavailability.In this experiment chitosan was degraded by α-amylase under ultrasonic wave，measuring degradation effect with the index of reducing sugar concentration.The orthogonal experiments were conducted obtain the optimal hydrolysis conditions.The results showed that the optimal technological condition was as follows：amylase addition 1 600 U/g，enzymolysis temperature 55℃，enzymolysis time under ultrasonic wave 50 min and pH 5.2.In these conditions，the concentration of reducing sugar was determined to 2.25 mg/mL，and the effect was better than the preparation effect by ultrasonic method and enzymatic hydrolysis respectively.The antioxidative activities of chito-oligosaccharides prepared by this method were studied.The results showed that chito-oligosaccharides demonstrated significant scavenging effects on DPPH and superoxide（O2-·）compared with ascorbic acid.

chito-oligosaccharides；ultrasonic wave；α-amylase；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.04.006

2014-01-24

黄河水利职业技术学院科研基金项目（2012QNKY011）

王振伟（1980—），男（汉），讲师，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。