猪轮状病毒VP7蛋白模拟表位的噬菌体展示技术筛选与鉴定

任晓峰，秦昭恒，曹丽艳，葛旭颖

（东北农业大学动物医学学院，哈尔滨150030）

摘要：猪轮状病毒（PoRV）是引起仔猪腹泻的重要病原之一，其主要结构蛋白衣壳蛋白VP7可诱导机体产生中和抗体。文章以制备的抗PoRV VP7单克隆抗体（MAb）3B6作为靶分子，利用噬菌体十二肽库展示技术对其模拟表位进行筛选。四轮筛选后随机挑取阳性克隆扩增后进行ELISA鉴定，同时提取其基因组DNA测序，10个阳性噬菌体亲和肽拥有共同的外源肽序列“VPLGTDNGDIWV”，而且与靶分子有很高亲和力。阳性噬菌体亲和肽与VP7蛋白进行序列比对，结果表明，十二肽中有4个氨基酸（第167位P、第178位T、第179位D和第184位W）与VP7蛋白167~184位氨基酸有一定的相似性。竞争抑制ELISA证明亲和多肽降低PoRV与抗VP7单克隆抗体之间的作用，病毒竞争抑制试验表明亲和多肽可以竞争性地抑制PoRV感染细胞。因此由这4个氨基酸构成的基序很有可能作为猪轮状病毒VP7蛋白的一个模拟表位。

关键词：猪轮状病毒；VP7蛋白；噬菌体筛选；模拟表位

任晓峰,秦昭恒,曹丽艳,等.猪轮状病毒VP7蛋白模拟表位的噬菌体展示技术筛选与鉴定[J].东北农业大学学报, 2015, 46(2): 11-17.

Ren Xiaofeng, Qin Zhaoheng, Cao Liyan, et al. Identification and characterization of porcine rotavirus VP7 protein mimotope by phage screening technique[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2015, 46(2): 11-17. (in Chinese with English abstract)

网络出版时间2015-1-27 15:59:35

[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20150127.1559.002.html

1.2.2亲和能力检测与测序

第四轮的洗脱物进行滴度测定，在蓝斑数小于100的板中，随机挑取10个蓝斑进行噬菌体扩增并测定滴度。用0.1 mol·L-1NaHCO3（pH 8.6）将纯化后的单克隆抗体腹水稀释至200 μg·mL-1，酶标板每孔加入100 μL，4℃包被过夜；弃去包被液，0.05% PBST洗板3次；分别加入10份待检的噬菌体及原始文库阴性对照，投入量均为1.5×1011PFU·孔-1，室温缓慢震荡1 h；TBST洗板3次，再加入1ϑ1 000倍稀释的抗M13噬菌体的商品化多抗，37℃慢摇1 h；TBST洗板3次，再加入1ϑ5 000倍稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG二抗，37℃静止避光孵育1 h；TBST洗板3次，OPD显色，490 nm处读取OD值。提取亲和能力高的噬菌体DNA：向500 μL噬菌体上清中加入200 μL PEG8000/NaCl，混匀后4℃静置10 min；4℃条件下13 000 r·min-1离心10 min，弃去上清后沉淀彻底重悬于100 μL碘化物缓冲液进行快速裂解，释放出其基因组DNA；加入250 μL无水乙醇沉淀DNA，室温静置孵育10 min；4℃条件下13 000 r·min-1离心10 min，弃去上清；加入70%的乙醇洗涤沉淀，弃去后再加入30 μL TE溶液溶解沉淀；PCR扩增噬菌体靶向序列[8]。

PCR反应参照NEB试剂盒说明书进行。取少量PCR产物进行鉴定，其余PCR产物待纯化后进行测序，噬菌体测序引物序列P3 5' GTATGGGATT TTGCTAAACAAC 3'，P4 5' CCCTCATAGTTAGCG TAACG 3'。

PCR反应体系10×PCR缓冲液2.5 μL，dNTP 2.5 μL，上下游引物各1 μL，Ex-Taq酶0.2 μL，噬菌体DNA 5 μL，补水至25 μL。

反应条件：95℃预变性5 min，94℃30 s，55℃3 s，72℃30 s进行30个循环，72℃延伸10 min[9-11]。

将靶向序列测序结果转换成氨基酸格式，并与PoRV VP7蛋白氨基酸序列进行比对（http://www. ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）。

1.2.3“P-TD-W“氨基酸基序与VP7蛋白三维结构的关系

为使噬菌体展示的多肽模拟表位更加形象化，从蛋白数据库（Protein data bank，PDB）得到猿猴轮状病毒A株（C3RX25）与PoRV（DN30209）VP7蛋白最相似，可作为一个模板，然后用Modeller程序（http://www.salilab.org/modeller/）分析蛋白分子模型[12-13]。与PoRV VP7蛋白同源性最高的氨基酸被标记出所在位置。

1.2.4多肽与MAb 3B6的结合ELISA试验

合成多肽P-VP7（纯度为30%）由ChinaPeptides（强耀生物科技有限公司，上海）合成，提前一天包被ELISA板，用包被液稀释为10 μg·mL-1，每孔50 μL，过夜。然后用封阻液封闭，分别用MAb 3B6和无关的鼠源IgG室温孵育1 h，HRP标记的山羊抗鼠的二抗（1ϑ5 000稀释），最后加入OPD显色液，用于ELISA检测，最后在OD490nm条件下读值。同时设立无关多肽为阴性对照，每个设3个复孔，用于误差计算。

1.2.5多肽的竞争性抑制ELISA试验

合成的多肽（10 μg·mL-1）与MAb 3B6（3 μg·mL-1）室温下孵育1.5 h。在已经包被感染了PoRV的细胞ELISA板上加入多肽和抗体的混合物，37℃作用1 h，PBST洗3次，二抗为1ϑ5 000稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG；最终进行OPD显色，并读取490 nm处OD值。无关多肽作为阴性对照，同时设立复孔。

1.2.6多肽与病毒的竞争抑制试验

多肽与病毒的竞争抑制试验通过病毒的蚀斑减少中和试验检测（PRNT），将MA104细胞传到24孔板内，细胞计数每孔细胞5×104个，待长满单层后，把P-VP7多肽从对细胞的最大无毒浓度连续两倍稀释加入孔内，无关多肽组（Irrelevant peptide）稀释相同的倍数作为阴性对照，每稀释度3复孔，每孔500 μL，37℃孵育45 min，用胰酶处理的PoRV（100 PFU）接种到24孔板中，37℃孵育1 h，然后换1%营养性甲基纤维素覆盖，置37℃、5%CO2的培养箱中培养，24 h后取出培养板，10%甲醛固定30 min，流水冲去孔中的甲基纤维素凝胶；0.5%结晶紫染色5 min，水洗；倒置显微镜下进行空斑计数。

2　结果与分析

2.1噬菌体筛选与富集

以纯化后的抗PoRV VP7蛋白单克隆抗体为靶分子进行四轮噬菌体筛选，将每一轮筛选过程中的包被量、噬菌体投入量、产出量进行统计，并比较每一轮的产出/投入比，结果见表1。在靶分子包被量递减、投入量不变的情况下，每一轮的噬菌体洗脱量及洗脱量/投入量均呈递增趋势。因此经过四轮筛选噬菌体得到明显富集。

表1　纯化的单克隆抗体3B6的噬菌体筛选Table 1　Biopanning to purified monoclonal antibody 3B6

2.2亲和能力的鉴定与测序

对第四轮筛选的洗脱产物进行滴度测定，选取蓝斑数小于100的平板，随机挑取10个单克隆噬菌体蓝斑进行扩增，并通过间接EILSA方法检测与靶分子的亲和能力。结果表明，与原始文库对照相比，10个随机噬菌体均与靶分子即纯化的单克隆抗体3B6，具有较高的亲和能力，如图1所示。随后，以10个随机噬菌体的基因组DNA为模板进行PCR，均扩增出长度约为250 bp的特异性条带（见图2）。将PCR产物纯化回收并进行核酸序列测定，并得出最终的12肽“VPLGTDNGDIWV”，命名为P-VP7。应用在线序列比对软件clustalw2，将筛选出的P-VP7的12肽序列与PoRV VP7蛋白进行氨基酸序列比对。结果如图3所示，P-VP7 的12肽与VP7蛋白第167至184位氨基酸具有一定的相似性，其中有四个位点的氨基酸完全一致（第167位P、第178位T、第179位D和第184 位W）。

图1　噬菌体亲和力试验ELISA结果Fig. 1　Binding analysis of phages displayed peptides to MAb 3B6 by ELISA

2.3“P-TD-W“氨基酸基序在VP7蛋白三维结构的位置

由图4可知，从PoRV VP7蛋白三维立体模型中可以看出167（P），178（T），179（D）或184（W）在VP7蛋白的位置。这些氨基酸残基与MAb 3B6结合的位置用黑色箭头标记突出显示。蛋白分子模型模拟结果显示，包含假定基序“P-TD-W”多肽可作为VP7蛋白第167~184个氨基酸位置的一个模拟表位。

图2　10个随机噬菌体的PCR扩增产物Fig. 2　PCR amplifying genes encoding heterologous peptides in the recombinant phages

图3　P-VP7与PoRV VP7 VP7蛋白氨基酸序列比对Fig. 3　Alignment of deduced amino acids between P-VP7 and PoRV VP7

图4　PoRV VP7 protein 3D结构模型Fig. 4　The 3D model of PRV VP7 protein 3D

2.4多肽与MAb 3B6的结合试验结果

包被合成多肽与MAb 3B6进行ELISA反应，结果P-VP7与MAb 3B6发生特异性反应，而对照孔包被的无关多肽与单抗不发生反应（见图5）。表明所合成的多肽能结合MAb 3B6，所筛的噬菌体是特异性针对MAb 3B6的阳性噬菌体克隆，而不是噬菌体本身蛋白发生的非特异性反应。

2.5多肽的竞争抑制ELISA结果

用合成的多肽进一步做PoRV竞争抑制试验，由图6可见，多肽能够抑制PoRV与单克隆抗体3B6的结合，抑制率达82%。证明噬菌体携带多肽形成的表位与单抗3B6识别的PoRVVP7的抗原表位相同或相似。

2.6多肽竞争抑制病毒的结果

由图7可知，P-VP7肽在一定浓度能竞争抑制PoRV感染MA104细胞的作用，而且从总体趋势上，P-VP7多肽浓度越高，对病毒竞争抑制作用越强，P-VP7多肽浓度为50、25和12.5 μg·mL-1时，在MA104细胞上的竞争抑制率为50%以上。

图5　合成多肽与单克隆抗体3B6的结合ELISAFig. 5　Combination ELISA of 3B6 IgG on synthesized peptide P-VP7

图6　P-VP7合成多肽抑制单克隆抗体3B6结合PoRV的ELISA试验Fig. 6　Inhibition of MAb 3B6 binding to PoRV in the presence of P-VP7 peptide

图7　多肽竞争抑制病毒试验Fig. 7　Inhibition test of PoRV propagation by high affinity peptide

3　讨论

猪轮状病毒引起的仔猪腹泻在英、美、澳大利亚等国家均有报道。作为腹泻的主要病原之一的轮状病毒给畜牧业造成严重经济损失。我国猪轮状病毒感染很普遍，几乎所有猪场的母猪血清中均可检测到轮状病毒抗体。根据对我国部分猪场PoRV的流行病学调查表明，PoRV G5型是我国A群猪轮状病毒主要流行的血清型之一，DN30209毒株属于PoRV G5型[14]，VP7蛋白在相同血清型不同毒株之间高度保守[15]，因此本试验选择该毒株的VP7蛋白进行抗原模拟表位筛选。

利用噬菌体筛选方法及多肽结合和竞争试验确定PoRV VP7蛋白上潜在的抗原表位：167P-TDW184，有助于深入了解的抗原或抗原-抗体相互作用的结构和功能，其对疫苗和诊断试剂的研发具有重要意义。抗原性表位可分为线性表位和构象表位。线性表位是抗原上彼此相邻的一级结构的几个氨基酸；构象表位是抗原上不连续的一级结构，或者是一些氨基酸残基彼此靠近的空间结构[16]。肽合成和蛋白质降解方法可用于确定线性表位，但未能确定构象表位。大多数抗原表位是构象表位。在噬菌体展示文库中，短肽随机片段插入丝状噬菌体蛋白PⅢ的N-末端，其已被成功地用于筛选由抗体或其他配体蛋白识别的抗原表位。采用这种技术，不仅可筛选线性表位，也可筛选潜在构象表位[17]。

在多肽与病毒竞争抑制试验中，多肽能抑制PoRV感染细胞，推测可能由于多肽具有与PoRV VP7蛋白中抗原表位相似的结构，多肽接触细胞后，可能占据细胞表面一部分受体，从而阻断一部分病毒侵染细胞，多肽抑制病毒感染的具体作用机制，还有待进一步研究。

然而，所述肽库具有小于10E9容量并不能掩盖一个十二肽（12E20组合）所有氨基酸组合。表明，十二肽库缺少理想的复合片段，除这些肽库库容量限制，其他因素包括密码子和氨基酸的修饰均受限于宿主菌。因此，建设具有大容量和良好多样性肽库是噬菌体展示肽库中的一个发展方向。另外，可诱变VP7上已被鉴定为模拟表位氨基酸，检测诱变前后PoRV活性，确定更关键位点。现有针对仔猪轮状病毒的疫苗不理想，评估模拟表位疫苗的临床应用需进一步探讨。

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Identification and characterization of porcine rotavirus VP7 protein

mimotope by phage screening technique/

Liyan, GE Xuying

(School of Veterinary Medicine, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:Porcine rotavirus (PoRV) causes diarrhea, vomit, dehydration, acid-base imbalance and death in piglets. PoRV VP7 is the outer capsid glycoprotein that is highly immunogenic and induce the production of neutralizing antibody. A prepared monoclonal antibody (MAb) 3B6 against PoRV VP7 protein was used as immobilized target in a subtract biopanning process using a 12-mer phage display random peptide library. After four rounds of pannings, 10 phages bearing the consensus peptide VPLGTDNGDIWV and having a specific binding activity to the target were identified. Sequence alignment between positive phage-displayed 12-mer peptide and VP7 protein suggested that a potential motif that is identical with 167(P), 178(T), 179(D) or 184(W) aa in the VP7 protein. Competition ELISA

猪轮状病毒（Porcine rotavirus，PoRV）属呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus，RV），是引起幼龄仔猪病毒性腹泻的主要病源之一[1]。PoRV在世界范围内广泛流行，断奶仔猪最为易感，主要临床症状为严重腹泻，部分感染PoRV的仔猪会出现厌食、呕吐、腹泻、脱水和酸碱平衡紊乱等症状，而且容易继发其他细菌性感染[2]，导致仔猪病死率升高，给养猪业造成重大损失[3]。轮状病毒是由11个不连续的双股RNA组成，编码6种结构蛋白（VPs）和6种非结构蛋白（NSPs）[4]。VP7蛋白作为轮状病毒外层最多的成分，是一种N-联低聚甘露糖糖蛋白，决定病毒的血清型，并可诱导产生中和抗体。

噬菌体展示技术是从随机肽库中筛选出能和靶蛋白发生特异性结合的表位，基本原理是将外源蛋白或多肽的基因与噬菌体外壳蛋白基因融合，以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达出多肽序列，保持特定的空间构象，利用特异性亲和作用来筛选特异性蛋白或多肽的一项技术[5]。抗原表位是可诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答的基本单位，也是抗原分子中与相应抗体特异性结合的部位，抗原表位的确定对疫苗设计，药物开发、以及相应免疫诊断方法的选择等具有指导意义[6]。本试验利用抗PoRV VP7单克隆抗体通过噬菌体展示技术鉴定出一个PoRV VP7蛋白一个抗原表位，有利于了解VP7蛋白抗原结构，为探究PoRV结构与功能关系提供理论依据，也为研制PoRV新型表位疫苗及诊断试剂奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料

噬菌体展示随机肽库Ph.D.-12TM试剂盒购自New England BioLabs公司，肽库的滴度为1.5×1013PFU·mL-1，宿主菌为E. coli ER2738；IPTG、X-gal、PEG8000、四环素（Tet）等化学试剂购自哈尔滨无限峰科技有限公司，为国产分析纯试剂；辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗M13单克隆抗体为NEB公司产品；辣根过氧化物酶（HRP）标记山羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；抗PoRV VP7单克隆抗体3B6株。

1.2方法

1.2.1验噬菌体筛选与扩增

应用噬菌体展示12肽筛选试剂盒对PoRV VP7单克隆抗体进行配体筛选，共进行四轮筛选，前三轮包括洗脱和扩增；第四轮仅进行洗脱。用0.1 mol·L-1NaHCO3（pH 8.6）将纯化后的单克隆抗体腹水稀释至200 μg·mL-1，取100 μL加入到酶标孔中，4℃包被过夜；第二天弃去包被液，0.01% PBST洗孔3次，然后用5% BSA在4℃条件下封闭4 h；弃去封闭液，0.1% TBST洗孔6次后，加入1.5×1011PFU·100 μL-1噬菌体原始文库，室温缓慢震荡10 min，静止10 min，再震荡10 min，静止10 min；弃去未结合的噬菌体，0.1% TBST洗孔10次，后加入100 μL洗脱液（0.2 mol·L-1glycine-HCl pH 2.2），室温缓慢震荡30 min；加入15 μL 1 mol·L-1Tris-HCl中和洗脱液；收获的洗脱液用于噬菌体扩增及滴度测定；将宿主菌ER2738 在LB培养板上划线并在37℃过夜培养。第二天挑取单个菌落于LB液体培养基中培养4.5 h，取200 μL宿主菌ER2738的菌液加入到20 mL LB液体培养基中，并加入每一轮筛选时未扩增的洗脱产物50 μL，37℃条件下剧烈震摇扩增4.5 h；菌液经10 000 r·min-1离心20 min，向上清中加入1/6体积的20% PEG8000/NaCl，混匀后4℃正立静置过夜；4℃，10 000 r·min-1离心15 min，弃去上清，沉淀重悬于1 mL TBS中；4℃，10 000 r·min-1离心5 min去除沉淀，上清转移至1.5 mL EP中，加入1/6体积的20% PEG8000/NaCl，混匀后4℃正立静置1 h；4℃，10 000 r·min-1离心15 min，弃去上清，用200 μL TBS重悬沉淀，此溶液为扩增后产物；滴度测定：用低盐LB 10倍倍比稀释待测噬菌体；每个稀释度取10 μL加入到200 μL宿主菌ER2378的新鲜菌液中，混匀后再转移

showed that the high affinity peptide reduced the combination of PoRV with anti-VP7 MAb. Moreover, this peptide could significantly inhibit PoRV propagation in cell culture. In conclusion, the 4 amino acid motif (P-TD-W) functions as a spatial conformation epitope of PoRV VP7 protein.

Key words:porcine rotavirus; VP7 protein; phage screening; mimic peptidebook=2,ebook=13至预热的液体顶层琼脂中混匀，混匀后的液体平铺于预热的LB/IPTG/X-gal固体平板上；待液体顶层琼脂冷却凝固后，将所有平板倒置于37℃温箱中避光培养过夜；第二天检查平板，第一个小于100的平板蓝斑数即为每10 μL噬菌体的PFU[7]。

作者简介：任晓峰（1974-2014），男，教授，博士，博士生导师，研究方向为预防兽医学与分子病毒学。E-mail: renxf@neau. edu. cnREN Xiaofeng, QIN Zhaoheng, CAO

基金项目：国家自然科学基金项目（31300758; 31340003）；“十二五”国家科技支撑项目（2013BAD12B04）；哈尔滨科学技术局项目（RC2012XK002003）；教育部重点项目（212038）

收稿日期：2014-04-03

文章编号：1005-9369（2015）02-0011-07

文献标志码：A

中图分类号：S828；S851