李其林 陆小娟 牛牧

姜黄素对人表皮黑素细胞活性、迁移及c-kit mRNA表达量的影响

李其林 陆小娟 牛牧

目的 探讨姜黄素对人表皮黑素细胞活性、黑素细胞迁移及c-kit mRNA相对表达量的影响。方法 不同浓度（5、10、20、30 μmol/L）姜黄素对人表皮黑素细胞活性影响实验，分为阴性对照组（添加MelM-2完全培养基＋细胞）、药物对照组（MelM-2完全培养基＋姜黄素）、空白对照组（仅添加MelM-2完全培养基）及实验组（MelM-2完全培养基＋姜黄素＋细胞），用MTS法分别检测培养24 h、48 h后细胞活性。划痕实验检测黑素细胞迁移的情况，实时荧光定量PCR检测黑素细胞c-kit mRNA相对表达量。实验分为对照组（仅添加MelM-2完全培养基＋细胞）及3个浓度（5、10、20 μmol/L）实验组。结果 不同浓度（5、10、20、30 μmol/L）姜黄素培养基培养黑素细胞24 h、48 h时，与对照组相比，30 μmol/L组均可明显抑制黑素细胞的增殖（P＜0.05），其他浓度差异无统计学意义（均P＞0.05）。划痕实验结果显示，与对照组相比，在培养48 h时，5、10、20 μmol/L姜黄素均能显著抑制黑素细胞迁移（均P＜0.05）。实时荧光定量PCR检测结果显示，与对照组相比，经各浓度（5、10、20 μmol/L）姜黄素作用48 h后，均可明显抑制黑素细胞c-kit mRNA相对表达量（均P＜0.05）。结论 低浓度的姜黄素（≤20 μmol/L）对黑素细胞无明显细胞毒性，30 μmol/L的姜黄素能够促进黑素细胞的凋亡。姜黄素（≤20 μmol/L）可抑制黑素细胞的迁移，并下调人表皮黑素细胞c-kit mRNA的相对表达量。

黑素细胞；姜黄素；细胞运动；原癌基因蛋白质c-kit；基因表达

黄褐斑是常见的色素增多性皮肤病，发病与色素代谢障碍［1］、氧化与抗氧化损伤系统失衡［2］、激素（孕激素、雌激素）、精神因素、遗传等因素有关［3］。临床上黄褐斑治疗方法较多，但疗效欠佳。姜黄素是从姜黄属植物根茎中提取出的一种植物多酚，研究发现其具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗动脉粥样硬化、抑制酪氨酸酶活性及抑制肿瘤生长等多种药理作用［4-5］。为了进一步研究姜黄素对黄褐斑等色素沉着性疾病的作用，我们用姜黄素处理体外培养人表皮黑素细胞，探讨对人表皮黑素细胞活性、迁移及与迁移密切相关的c-kit mRNA相对表达量的影响，为姜黄素对人表皮黑素细胞的调节作用提供更多实验依据，也为临床治疗黄褐斑等色素沉着性疾病拓展新的方向。

资料与方法

一、资料

1.细胞来源：正常人表皮黑素细胞来自广州市红十字会医院泌尿科手术室提供的青少年男性包皮环切术的包皮组织。本研究经过医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

2.主要试剂：姜黄素为美国Sigma公司产品，以二甲基亚砜（DMSO）溶解配制成10 mmol/L的母液，置于-20℃冰箱避光保存，保质期半个月，药品临用前加新鲜MelM-2完全培养基（美国Sciencell公司）调配至实验所需浓度。人黑素细胞生长添加剂MelGS-2（美国Sciencell公司），鼠抗人HMB-45单克隆抗体（美国Abcam公司），RNase（上海瑞齐生物科技有限公司），荧光定量PCR试剂（日本Takara公司）。

二、方法

1.黑素细胞的分离培养：收集包皮组织，70%乙醇消毒后冲洗，剔除真皮及皮下脂肪组织，将组织剪成1 mm×2 mm长方形，加入0.25%DispaseⅡ分离酶，消化16～18 h后，分离表皮、真皮。加入胰蛋白酶室温下消化后制成黑素细胞悬液。过滤，离心，接种至25 cm2无菌培养瓶中。

2.多巴染色法鉴定黑素细胞：将细胞接种于盖玻片，贴壁后，加入预热至37℃的4%甲醛固定。将盖玻片浸润于左旋多巴（L-Dopa）染色液中，置于37℃下孵育40 min，随后更换新染液。约3 h后，染液呈棕色或黑色，停止染色。漂洗，苏木素复染细胞核，脱色，梯度酒精法逐级脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。

HMB-45免疫化学染色法鉴定黑素细胞：爬片固定后，加入过氧化物酶溶液，孵育后冲洗，再加入0.1%Triton X100/PBS，室温下放置30 min。每张细胞爬片滴入1滴正常非免疫动物血清，置于孵箱中30 min，用枪头吸取血清后，加入一抗置4℃冰箱过夜。次日，将细胞爬片温箱中30min，冲洗后每张细胞爬片加入1滴生物素标记二抗，置于孵箱中30 min，PBS缓冲液清洗。每张细胞爬片滴入1滴链霉素抗生物素过氧化物酶溶液后，置于37℃温箱中孵育30 min，PBS缓冲液冲洗后，加入DAB显色，观察到棕黄或棕褐颗粒为阳性，终止显色。苏木素复染细胞核，脱色，梯度酒精法逐级脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。

3.姜黄素对人表皮黑素细胞活性的测定（MTS法）：设立阴性对照组（添加MelM-2完全培养基＋细胞）、药物对照组（MelM-2完全培养基＋姜黄素）、空白对照组（仅添加MelM-2完全培养基）及实验组（MelM-2完全培养基＋姜黄素＋细胞），实验组设4个复孔。根据预实验结果，设定姜黄素的实验浓度。将黑素细胞接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后弃上清液，分别加入新鲜配制的浓度分别为5、10、20、30 μmol/L的姜黄素完全培养基100 μl；阴性对照组更换MelM-2完全培养基100 μl；药物对照组分别添加上述浓度姜黄素培养基100 μl；空白对照组仅添加MelM-2完全培养基100 μl。培养24、48 h后分别加入冷藏的MTS显色液，每孔20 μl，4 h后终止培养。将96孔细胞培养板置于酶标仪490 nm波长处行各孔光吸收值（A）的检测。用增殖比例表示细胞增殖情况，即各实验组的细胞增殖比例=（A实验组-A药物对照组）/（A阴性对照组-A空白对照组）× 100%。本实验重复3次，取均值。

4.姜黄素对人表皮黑素细胞迁移能力的测定（划痕实验）：设立对照组（仅添加MelM-2完全培养基）及3组实验组（设定姜黄素的实验浓度为5、10、20 μmol/L）。先用丝裂霉素提前16 h作用于黑素细胞，再将黑素细胞接种于6孔培养板内。在黑素细胞完全融合的6孔板细胞内，采用无菌的1 ml枪头在每孔中划出等宽的直线划痕，然后用PBS缓冲液轻轻洗去脱落细胞的碎片，分别加入含有各试验浓度的姜黄素完全培养基（不含FBS和MelGS-2），置于培养箱中继续培养。48 h后拍照并使用图像分析软件IPP 6.1分析。倒置显微镜下观察、照相、计数、计数划痕部位各组迁移细胞数量，本实验重复3次，取均值。

5.荧光定量PCR检测姜黄素对c-kit mRNA相对表达量的影响（SYBR Green法）：设立对照组（仅添加MelM-2完全培养基）及3组实验组（设定姜黄素的实验浓度为5、10、20 μmol/L），每组设3个复孔。将黑素细胞接种于6孔细胞培养板，置于培养箱中培养24 h，待细胞贴壁后弃上清液，分别加入上述新配制的姜黄素完全培养液继续孵育。对照组更换MelM-2完全培养基。各实验组与对照组均于48 h后终止培养并检测各项指标。

6.引物探针设计合成：在基因库上查找目的基因mRNA序列，在CDS区设计特异性引物使用Primer express 2.0软件设计引物探针，序列如下：HC-KIT（扩增片段长度121 bp）上游引物：5′-GGCAG CCAGAAATATCCTCCT-3′，下游引物：5′-CACAGG TAGTCGAGCGTTTCCT-3′。H-β肌动蛋白（扩增片段长度106 bp）上游引物：5′-GCATGGGTCAGAAG GATTCCT-3′，下游引物：5′-TCGTCCCAGTTGGTGA CGAT-3′。RNA的提取：各实验组及对照组的黑素细胞总RNA采用Trizol一步法进行提取。β肌动蛋白作为内参照。去基因组：使用Nase-free的DNaseⅠ（美国Promega公司）以下体系配置反应液，37℃消化30 min，65℃灭活10 min。反转录反应：取4 μl RNA模板做反转录反应，反应条件为37℃15 min，然后85℃5s。荧光定量PCR反应：反应条件为93℃2 min，93℃15 s，55℃25 s，72℃25 s，共40个循环。每个样本重复3次。

结果

一、正常人表皮黑素细胞的培养及鉴定

培养24 h时大部分细胞可贴壁，镜下可见散在分布的梭形或多角形细胞，树突少而细长，少量呈圆形、胞质透明的细胞。24 h后首次换液，以后每隔2～3 d换1次液，镜下可观察到黑素细胞逐渐增多，树突数量逐渐增加至2个以上，角质形成细胞也呈“铺路石样”聚集。约8～15 d黑素细胞及角质形成细胞接近80%融合，此时可传代。见图1。

图1 正常人表皮黑素细胞（×100）

L-DOPA染色鉴定人表皮黑素细胞：正常人表皮黑素细胞经L-DOPA染色后，可呈阳性反应，各细胞树突及胞质呈灰棕色或棕褐色。见图2。

图2 L-DOPA染色阳性人表皮黑素细胞（×100）

HMB-45免疫组化染色鉴定：经HMB-45染色，镜下胞质呈棕黄色或棕褐色，表明染色结果为阳性，证明该细胞可正常合成黑素，为成熟黑素细胞。见图3。

图3 HMB-45染色阳性人表皮黑素细胞（×100）

二、不同浓度姜黄素对黑素细胞活性的影响

各组数据经两因素多个水平的析因设计与方差分析检验后，结果显示不同浓度姜黄素溶液对黑素细胞增殖的影响不同（F=43.617，P=0.000），差异有统计学意义，即姜黄素溶液浓度越高对黑素细胞越有抑制作用。不同时间对黑素细胞的增殖也有影响（F=11.459，P=0.000），差异有统计学意义，即随着姜黄素溶液作用时间越长对黑素细胞越有抑制作用。不同浓度姜黄素溶液与时间有交互作用（F=3.168，P＜0.05），差异有统计学意义，即随着姜黄素溶液浓度的增加及作用时间的增长，对黑素细胞的抑制作用增强。见表1。

三、不同浓度姜黄素对黑素细胞迁移的影响

培养48 h时观察细胞迁移情况。单因素方差分析结果显示，F=1534.467，P＜0.001，不同浓度姜黄素对黑素细胞迁移率的差异有统计学意义。Levene方差齐性检验显示，F=1.181，P=0.376，按α=0.1水准，满足方差齐性。采用SNK法进行多重比较显示，与对照组（80.25%±1.48%）相比，5、10、20 μmol/L的姜黄素可明显抑制黑素细胞的迁移，迁移率分别为 65.82% ±0.63%，51.30% ±0.92%，21.50% ± 0.92%；差异均有统计学意义（P值分别为0.004、＜0.001、＜0.001）。

表1 不同浓度姜黄素对黒素细胞活性的影响（±s）

表1 不同浓度姜黄素对黒素细胞活性的影响（±s）

注：n=3。a：仅有培养基；b：培养基＋黑素细胞；c：培养基＋各浓度姜黄素；d：培养基＋黑素细胞＋各浓度姜黄素；e：与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）

组别 24 h 48 h空白对照组a 0.009±0.001 0.008±0.001阴性对照组b 1.000±0.018 0.993±0.064药物对照组c 5 μmol/L姜黄素 0.035±0.005 0.037±0.003 10 μmol/L姜黄素 0.031±0.004 0.033±0.004 20 μmol/L姜黄素 0.032±0.002 0.035±0.002 30 μmol/L姜黄素 0.039±0.003 0.040±0.002实验组d 5 μmol/L姜黄素 1.007±0.064 0.959±0.029 10 μmol/L姜黄素 0.970±0.030 0.885±0.033 20 μmol/L姜黄素 0.870±0.066 0.877±0.025 30 μmol/L姜黄素 0.783±0.053e 0.637±0.015e

四、不同浓度姜黄素对黑素细胞c-kit mRNA表达的影响

培养48 h时，单因素方差分析结果显示，F= 39.115，P＜0.001，不同浓度姜黄素组黑素细胞c-kit mRNA相对表达量不完全相同。方差齐性检验显示，F=3.640，P=0.064，按α=0.10水准，尚不能认为4组资料方差齐。采用Tamhane T2进行多重比较，与对照组（3.371±0.352）相比，5、10、20 μmol/L姜黄素在培养 48 h时均能显著抑制黑素细胞 c-kit mRNA表达（c-kit mRNA相对表达量分别为1.799± 0.372，1.539±0.224，1.026±0.038），P值分别为0.025、0.012、0.021，且呈浓度依耐性，以20 μmol/L的姜黄素抑制最显著。

讨论

研究发现，姜黄素具有抗炎、抗细菌、抗氧化、抗肿瘤、抑制酪氨酸酶活性的作用［6-7］。林茂等［8］通过探讨姜黄素对体外原代培养的正常人表皮黑素细胞黑素生成及酪氨酸酶活性的影响，推测姜黄素对黄褐斑等色素性皮肤病有一定的治疗作用。但其具体机制仍不清楚，为了进一步研究姜黄素治疗色素沉着性疾病的作用及其机制，我们通过体外培养人表皮黑素细胞，探讨姜黄素对人表皮黑素细胞活性、迁移及与迁移密切相关的c-kit mRNA相对表达量的影响。

黑素细胞分别经5、10、20 μmol/L浓度的姜黄素培养基作用24、48 h后，细胞形态学上未见明显改变。但经30 μmol/L浓度的姜黄素培养基处理24 h后，部分黑素细胞出现了核固缩，树突收缩及折光性减弱，且细胞数目较空白对照组减少。采用MTS法检测细胞活性，发现当姜黄素达到30 μmol/L时对黑素细胞有明显的毒性作用，提示低浓度的姜黄素对黑素细胞无明显毒性作用，但30 μmol/L的姜黄素可直接引起细胞凋亡。有关黑素细胞凋亡的具体机制，目前仍然不清楚。研究发现，19 000磷蛋白靶向作用可以消除活化的黑素细胞，其表达上调或下调都会抑制黑素细胞的活性，从而黑素含量和酪氨酸酶活性都会降低。19 000磷蛋白1是正常分化的黑素细胞直接的抑制开关，而能调节19 000磷蛋白l的因子是治疗局限性色素沉着的潜在途径之一。姜黄素是如何引起黑素细胞的凋亡，其凋亡是否与上述凋亡蛋白酶相关，这些尚待进一步研究。

有学者认为，黑素细胞的迁移是依赖于膜结合的c-kit受体，c-kit受体通过跨膜二聚化或突变体的基底目标而改变上皮内黑素细胞定位、存活及与上皮细胞的粘附［9］。Oba-Shinjo等研究发现黑素细胞的黏附、迁移与细胞外基质具有密切关联。黑素细胞为贴壁生长的细胞，自身不能分泌细胞外基质，但可与周围的细胞外基质黏附从而发生一系列变化［10］。有学者发现，当黑素细胞处于增殖状态时，与细胞外基质纤维连接蛋白的黏附性可增强［11］。本研究为观察姜黄素对表皮黑素细胞的迁移情况，我们的预实验用丝裂霉素提前16 h作用于黑素细胞，以期在不损伤细胞活性的前提下终止黑素细胞的增殖，观察姜黄素对黑素细胞迁移情况的影响，结果提示5、10、20 μmol/L的姜黄素可抑制黑素细胞的迁移，差异有统计学意义，且随着的浓度的增大，对黑素细胞的抑制越显著。我们采用荧光定量PCR检测经不同浓度姜黄素作用后人表皮黑素细胞c-kit mRNA的相对表达量，结果显示，姜黄素在20 μmol/L的范围内，可下调黑素细胞c-kit mRNA的相对表达量。因此，通过本研究，我们认为姜黄素在低浓度时对黑素细胞无明显细胞毒性，30 μmol/L的姜黄素可引起黑素细胞的凋亡从而直接抑制局部黑素细胞的增殖。姜黄素可下调黑素细胞c-kit mRNA相对表达量，并对黑素细胞的迁移能力有抑制作用。这些结果表明，姜黄素具有开发为美白产品的潜能，为治疗黄褐斑等色素沉着性疾病提供了一定的依据，但姜黄素是如何抑制酪氨酸酶活性及黑素细胞的迁移，它通过什么途径诱导黑素细胞的凋亡，尚待进一步研究。

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Effect of curcumin on the activity and migration of as well as c-kit mRNA expression in melanocytes

Li Qilin, Lu Xiaojuan,Niu Mu.Department of Dermatology,Fourth Affiliated Hospital of Jinan University,Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510220,China
< class="emphasis_italic">Corresponding author:Li Qilin,Email:qlli_cn@163.com

Li Qilin,Email:qlli_cn@163.com

ObjectiveTo explore the effect of curcumin on the activity and migration of as well as c-kit mRNA expression in melanocytes.MethodsHuman epidermal melanocytes were isolated from the prepuce in adolescents and subjected to primary culture.To estimate the effect of curcumin on the proliferative activity of melanocytes,some melanocytes were randomly divided into several groups to be cultured in the MelM-2 medium with or without the presence of 5,10,20 or 30 μmol/L curcumin,the MelM-2 medium containing curcumin of 5－30 μmol/L served as the drug control groups,and the MelM-2 medium without curcumin served as the blank control group.After 24 and 48 hours of culture, MTS assay was performed to evaluate the proliferative activity of melanocytes.Some cultured melanocytes were randomly divided into 4 groups to be cultured in the MelM-2 medium with 0,5,10 and 20 μmol/L curcumin respectively for 48 hours.Then,wound scratch assay was conducted to estimate the migratory activity of melanocytes,and real-time fluorescence-based quantitative PCR to quantify the mRNA expression of c-kit in melanocytes.Statistical analysis was carried out by factorial design analysis of variance（ANOVA）,one-way ANOVA and least significant difference（LSD）-ttest.ResultsThe proliferative activity of melanocytes was significantly decreased at 24 and 48 hours in the 30-μmol/L curcumin group compared with the negative control group（0.783±0.053 vs.1.000±0.018 at 24 hours,0.637±0.015 vs.0.993±0.064 at 48 hours,bothP＜0.05）,while no significant differences were observed between the other curcumin groups and the negative control group（allP＞0.05）.The 48-hour treatment with curcumin could significantly inhibit the migration of melanocytes in the 5-,10-and 20-μmol/L curcumin groups compared with the control group（allP＜0.05）. The mRNA expression level of c-kit was also significantly reduced at 48 hours in the 5-,10-and 20-μmol/L curcumin groups compared with the control group（1.799±0.372,1.539±0.224 and 1.026±0.038 vs.3.371±0.352,allP＜0.05）.ConclusionCurcumin at low concentrations（≤20 μmol/L）has no obvious cytotoxicity against melanocytes, but can inhibit the migration of and c-kit mRNA expression in melanocytes,while curcumin at 30 μmol/L can promote the apoptosis of melanocytes.

Melanocytes;Curcumin;Cell movement;Proto-oncogene proteins c-kit;Gene expression

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2015.10.010

广东省科技计划项目（粤科函规财字［2014］807号）

510220广州，暨南大学第四附属医院、广州市红十字会医院皮肤科

李其林，Email：qlli_cn@163.com

2015-01-26）

（本文编辑：吴晓初）