王雅群，潘道东（宁波大学海洋学院，浙江宁波315211）

磁性分子印迹固相萃取食品中的四环素类抗生素残留

王雅群，潘道东*
（宁波大学海洋学院，浙江宁波315211）

采用表面分子印迹技术合成对四环素类抗生素具有特异性吸附性能的Fe3O4@SiO2@MIP核壳型纳米复合材料，经磁分离固相萃取-高效液相色谱（MSPE-HPLC）技术，同时测定样品中3种四环素类抗生素的残留。用扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）和红外色谱（FT-IR）对其表征。该方法对于四环素、土霉素、金霉素的检出限分别为9.61、7.84、11.93 μg/kg，且在线性范围内线性关系良好。最大吸附量为56.28 mg/g。该方法的平均加标回收率在93.71%～100.88%之间，变异系数1.54%～7.44%。与非分子印迹聚合物相比，Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物的吸附特异性较强。

四环素类抗生素，Fe3O4纳米粒子，分子印迹，固相萃取，高效液相色谱

四环素类抗生素（Tetracycline Antibiotic）为广谱型的抗菌药，常见的有四环素（Tetracycline，TC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC）和金霉素（Chlortetracycline，CTC），主要用于预防和治疗畜禽疾病，但由于药物的不合理使用，动物源食品中常存在四环素类药物的残留问题。美国食品药品管理局规定上述3种四环素类抗生素最大残留量为2 μg/g，中国农业部规定3种四环素类抗生素最大残留量为100 ng/g。因此，食品中四环素类抗生素的检测十分重要。

目前关于四环素类抗生素检测方法，大致可以分为四类：微生物检测法［1］，是最常用的方法，但该方法复杂、耗时、准确性不高；高效毛细管电泳法，有自动化程度高、微量等优点，但存在分析精度不高、专属性鉴定尺度不易掌握等问题［2］；免疫分析法，因其前处理简单、灵敏度高等优点，在分析领域占据非常重要的地位，但有检测对象单一的缺点［3］；仪器分析法，随着科技的进步以及分析仪器的普及。仪器分析法因具有高灵敏度、快速、准确的特点得到青睐，在多残留定性定量分析方面优势突出［4］。食品因其组成基体非常复杂，所以样品前处理是多残留检测的关键。而固相萃取技术因其设备简单、自动化程度高等优点，已广泛用于样品前处理［5］。为提高萃取过程特异性，以分子印迹聚合物作固相萃取剂，对样品前处理，可提高检测特异性、准确性［6］。近年来，因磁性纳米复合材料成本低廉、表面易于改性和磁向导性等优势，使其在靶向药物医学、临床诊断以及细胞固定化等领域得到广泛的应用［7-11］。同时，磁性纳米印迹材料与传统的分子印迹材料相比，省去了离心、过滤等复杂过程，简化了操作步骤和操作时间，使得样品前处理更快速、更高效［12］。

本文主要合成了Fe3O4@SiO2@MIP核壳型纳米分子印迹聚合物，并使用该聚合材料作为固相萃取剂，结合高效液相色谱法，同时测定样品中3种四环素类抗生素的残留。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

强力霉素（Doxycycline，DOX）、四环素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）、N，N-二甲基乙酰胺（DMAC） 阿拉丁试剂有限公司；3-巯丙基三甲氧基硅烷（MPTS）、甲基丙烯酸（MAA） 国药集团化学试剂有限公司；三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酸酯（TRIM） 玛雅试剂有限公司；偶氮二异丁腈（AIBN）

天津市光复精细化工研究所；四乙氧基硅烷（TEOS） 上海泰坦科技股份有限公司；乙腈、甲醇均为色谱纯迪马科技有限公司；4种抗生素结构式为：

HH-S数显恒温油浴金坛市精达仪器制造有限公司；JEOL2100透射电子显微镜（TEM） 日本JEOL电子株式会社；SU-70场发射扫描电镜（SEM） 日本日立；湘仪H-2050离心机湘仪离心机仪器有限公司；傅立叶变换红外光谱仪IRAffinity-1日本岛津；高效液相色谱（Agilent 1260） 德国安捷伦公司。

1.2实验方法

1.2.1磁性分子印迹聚合物的制备

1.2.1.1超顺磁性Fe3O4粒子的制备超顺磁性Fe3O4磁性纳米粒子水悬浮液采用化学共沉淀方法制备。取500 mL的烧瓶，将3.45 g FeCl2·4H2O、9.46 g FeCl3·6H2O分别溶于除氧的160 mL双蒸水中，氮气保护下800 r/min强机械搅拌，溶液加热至80℃后，加入25 mL氨水，使反应溶液呈碱性。反应进行40 min，冷却后磁分离，倒出上清液，用双蒸水和乙醇多次淋洗，除去杂质，真空冷冻干燥，即得到黑色超顺磁性Fe3O4纳米颗粒［13］。

1.2.1.2Fe3O4@SiO2的制备取烧瓶，分别加入120 mg Fe3O4纳米材料、200 mL异丙醇、20 mL双蒸水，混匀，40 Hz超声20 min。在800 r/min持续机械搅拌下，连续加入22 mL氨水和4.2 mL的TEOS，室温下反应24 h后，磁分离除上清液，多次清洗，冷冻干燥，得Fe3O4@SiO2纳米粒子。

1.2.1.3沉淀聚合法合成Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物取圆底烧瓶，依次加入30 mg Fe3O4@SiO2纳米支撑载体、3.0 mmol强力霉素模板分子、60 mL乙腈/甲醇（35∶30，V/V）致孔剂、0.68 mL甲基丙烯酸（MAA）功能单体，超声除氧，加入10 mmol三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酸酯（TRIM）交联剂，45 mg偶氮二异丁腈（AIBN），持续通入氮气，搅拌聚合24 h后，抽滤、洗涤，索氏提取24 h，去除模板分子，冷冻干燥，得Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物。按照以上方法，不加强力霉素，合成对照组的核壳型Fe3O4@SiO2@NIP非分子印迹聚合物［14］。

1.2.1.4结构表征扫描电子显微镜（SEM）：采用导电胶粘结法。先在样品台上贴上一短条导电胶带，然后在胶带上撒少量纳米分子粉末，反置样品台，使未粘上的样品脱落，并用吸耳球轻吹表面，待测。

透射电子显微镜（TEM）分析：取少量样品粉末于小烧杯中，加入乙醇溶解，超声分散20 min，用1 mL移液枪转移一小滴到200目的铜网上，静置干燥30 min，待测。

傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析：表征样品与溴化钾（KBr）以1∶50的比例研磨成粉，压制成片，数据测试波长范围为400～4000 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描扣除CO2干扰。

1.2.1.5色谱条件色谱柱：ZORBAX Eclipse XDBC18，4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent；流动相：0.01 mol/L磷酸二氢钠（pH2.8）水溶液∶乙腈=79∶21；检测波长：355 nm；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL；柱温：30℃。

1.2.1.6标准曲线用甲醇做溶剂，配制浓度为0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.10 μg/mL的四环素和土霉素，浓度为0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、2.00、2.20 μg/mL金霉素的混合标准溶液，按上述色谱条件，作线性回归分析。以标准溶液的浓度为横坐标X，以对应液相色谱的峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得线性回归方程。

1.2.2静态吸附实验为了进一步研究核壳型Fe3O4@SiO2@MIP纳米分子印迹聚合物的吸附能力，设计静态吸附实验，并运用Scatchard分析实验结果。取10个10 mL离心管，分别加入50 mg的Fe3O4@SiO2@MIP纳米分子印迹聚合物，加入5 mL浓度不同（浓度范围0.2～2 mg/mL）的四环素类抗生素甲醇/水（95∶5，V/V）溶液，混匀振荡8 h后，磁分离，并收集上清液，用高效液相色谱测定，每个浓度设置三组重复。依据吸附平衡公式（1），计算平衡吸附量Q（mg/g）：

式中：V表示溶液体积（mL）；m表示Fe3O4@SiO2@ MIP纳米分子印迹聚合物质量（g）；C0表示溶液初始浓度（mg/mL）；Ce表示溶液吸附平衡浓度（mg/mL）。

按照以上方法测定核壳型Fe3O4@SiO2@NIP纳米分子印迹聚合物对土霉素的静态吸附并进行比较。

1.2.3样品测定

1.2.3.1样品预处理样品中四环素类抗生素的提取采用Mcllvaine缓冲溶液稀释法，配制Mcllvaine缓冲溶液［15］，固体样品用组织捣碎机绞碎均匀，将其加入4倍质量的上述缓冲溶液，冰水浴超声浸提20 min，5000 r/min离心15 min，残留物用相同方法重复浸提1次，合并浸提液，冷藏待测。

1.2.3.2固相萃取首先，准确称取50 mg铁纳米分子印迹聚合物，作固相萃取剂，置于离心管中，经10 mL甲醇活化后，双蒸水清洗至少3次，磁分离，载入5 mL待测浸提液，塞紧瓶口，平放离心管，室温下吸附30 min后，磁分离，双蒸水清洗淋洗，去除未被吸附的物质，再用5 mL甲醇/2%甲酸水溶液（V/V，90∶10）进行洗脱，收集洗脱液，氮气吹干后，5 mL流动相稀释，用高效液相色谱测定待测液中的3种四环素类抗生素的浓度。

1.2.3.3加标实验加标实验过程中，牛奶样品是将3种不同四环素类抗生素加入牛奶样品中，使土霉素、四环素加标浓度分别为0.2、0.4、0.8 μg/mL，金霉素浓度为0.4、0.8、1.6 μg/mL；禽肉、鱼肉是将组织捣碎，称取100 mg的样品，使土霉素、四环素加标浓度分别为0.2、0.4、0.8 μg/g，金霉素加标浓度为0.4、0.8、1.6 μg/g。每个浓度做5次重复。

1.2.4数据处理方法Origin 9.0.0（OriginLab OriginPro 9.0.0，Origin，ElectronicArtsInc，Cary，Microsoft Windows，USA，2011）用于数据分析和绘图。

2　结果与讨论

2.1磁性分子印迹聚合物的表征

2.1.1扫描电镜（SEM）图分析扫描电镜是最直观也是目前最常用的观察聚合物表面微观形态的手段，本文用扫描电子显微镜观察Fe3O4@SiO2@MIP纳米粒子的表面形态，并与Fe3O4纳米颗粒进行比较（图1）。由图1可以看出，Fe3O4@SiO2@MIP印迹聚合物与Fe3O4纳米相比，直径略有增大。Fe3O4纳米颗粒外观更为清晰纯净，而Fe3O4@SiO2@MIP印迹聚合物表面更为粗糙，且团聚程度略大于Fe3O4纳米颗粒，这与合成Fe3O4@SiO2@MIP的沉淀聚合法有关。

图1　Fe3O4纳米粒子（A，B，100000×）与Fe3O4@SiO2@MIP印迹聚合物（C，D，200000×）不同放大倍数的扫描电镜图Fig.1　Scanning electron micrographs of Fe3O4nano-particles（A，B，100000×）and Fe3O4@SiO2@MIP（C，D，200000×）under different magnifications

2.1.2透射电镜（TEM）图分析为了进一步观察Fe3O4@SiO2@MIP印迹聚合物与Fe3O4纳米粒子的内部形貌，采用透射电子显微镜观察。从TEM图明显看出，纳米粒子大小均匀基本呈球形，而且也没有特别明显的分相。Fe3O4@SiO2@MIP印迹聚合物粒径更大，约20～30 nm，而Fe3O4纳米粒径约10～20 nm，可以证明表面印迹成功。

图2　Fe3O4纳米粒子（A，200000×）与Fe3O4@SiO2@MIP印迹聚合物（B，200000×）的透射电镜图Fig.2　Scanning transmission electron micrographs of Fe3O4nano-particles（A，200000×）and Fe3O4@SiO2@MIP（B，200000×）

2.1.3红外图谱（FT-IR）分析红外光图谱的特异性程度较高，可以用来研究分子的结构和化学键，也可用来表征和鉴别化合物。分别测定了Fe3O4纳米材料、硅烷化的Fe3O4@SiO2纳米聚合物和Fe3O4@SiO2@MIP印迹聚合物的红外光谱图（图3）。

图3　Fe3O4、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@SiO2@MIP的红外光谱Fig.3　FI-IR spectra of Fe3O4、Fe3O4@SiO2and Fe3O4@SiO2@MIP

在红外光谱图中，Fe3O4吸收峰在580～400 cm-1之间，很明显，图3中445.56 cm-1为Fe3O4的Fe-O弯曲振动特征峰，592.12 cm-1为Fe3O4的Fe-O伸缩振动特征峰基团频率发生位移［16］。1317.37 cm-1是Si-O-Si反对称振动吸收峰，1120.64 cm-1是Si-O的伸缩振动特征吸收峰，而且此时氧原子的活性较强，因此，可以推断Fe3O4纳米粒子表面成功硅烷化。3406.85 cm-1是H-O的伸缩振动特征吸收峰，是一个较宽的吸附谱带，是材料中的吸附水和游离水产生的。1625.98 cm-1是游离水中的H-O-H弯曲振动的吸收带［17］。

2.2吸附实验

2.2.1分子印迹聚合物和非分子印迹聚合物对土霉素的吸附比较图4为Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物与非分子印迹聚合物对土霉素的吸附曲线。可见，Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物对土霉素的吸附作用明显大于非分子印迹聚合物的吸附作用，说明Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物具有更为良好的选择性吸附作用，且吸附量均是随着初始浓度的增加而增大。

图4　Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物和Fe3O4@SiO2@NIP非分子印迹聚合物对土霉素的吸附Fig.4　Absorption of Fe3O4@SiO2@MIP imprinted polymers and Fe3O4@SiO2@NIP non-molecularly imprinted polymers with OTC

2.2.2分子印迹聚合物对三种抗生素的静态吸附与分析分子印迹聚合物对目标化合物的吸附，主要受两种因素影响，即孔穴大小与目标化合物结构适应度、功能单体与目标化合物的匹配度。由图5分析得知，Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物对土霉素和金霉素均具有良好的吸附性，因为使用强力霉素作为模板分子，尽管其与四环素分子量大小一致，但四环素分子结构中缺少了醇羟基，导致其与以强力霉素作为模板分子的印迹聚合物的识别位点、基团性质差异变大、匹配度降低，导致吸附特性降低，因此对四环素的吸附作用相对偏低。

图5　Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物对四环素、金霉素和土霉素的静态吸附Fig.5　Static absorption of Fe3O4@SiO2@MIP molecularly imprinted polymers with TC，CTC and OTC

一般用Scatchard分析考察Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物的吸附特性［18-19］。以吸附量对吸附量/平衡浓度作图，得到Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物对土霉素吸附Scatchard分析图（图6）。从图6可知，Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物平衡解离常数Kd在0.17～0.96 mg/mL之间，最大吸附量Qmax为56.28 mg/g，吸附能力略大于非分子印迹聚合物，而非分子印迹聚合物最大吸附量为41.55 mg/g。

图6　Scatchard分析图Fig.6　The Scatchard analysis of absorption

从图6中可以看出，Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物的吸附曲线不呈直线关系，在图的两端有两条线性关系的部分，说明在实验浓度范围内并不是完全等价的，而是有两类不同性质的吸附结合位点，一类是亲和力较强的结合位点，另一类是亲和力较弱的结合位点。当吸附趋于平衡时，较弱的低结合位点与印迹分子相互发生协同作用，通过类似“诱导契合”的方法进行识别吸附［20］。当底物浓度较低时，高亲结合位点作用明显，其吸附贡献大于低结合位点，低结合位点的吸附作用可忽略不计；当底物浓度较高时，高结合位点的吸附贡献仍较大，但是低结合位点吸附的优势显现出来。而图6b的Scatchard吸附分析曲线呈线性关系的，表明在研究范围内，Fe3O4@ SiO2@NIP纳米材料对目标物的的吸附作用是均一的、相同的，即随着浓度的增加，吸附量对吸附量/平衡浓度也随之增加，吸附贡献主要来自于物理吸附，并非如Fe3O4@SiO2@MIP的两种吸附共同作用的结果。

2.3方法评价

2.3.1标准曲线标准曲线实验结果如表1所示。实验表明，三种四环素类抗生素在此浓度范围内线性关系良好（R2均大于0.999），方法灵敏度高。

表1　四环素类抗生素标样的线性方程和相关性系数Table 1　Linear equations and correlation coefficients of tetracycline’s standard reagents

2.3.2检出限方法的检出限是按照上述确定的液相色谱检测方法，配制浓度较低的标准溶液，观察液相色谱的信噪比，并稀释标准溶液，至信噪比为3∶1时，此时标准溶液的浓度即为该方法的检出限。结果表明，该方法对四环素、土霉素、金霉素的检出限分别为9.61、7.84、11.93 ng/mL。

2.3.3加标回收实验图7是鹅胸肉的加标样品液相色谱图，由图7可知，三种四环素类抗生素在上述液相色谱实验条件下，15 min之内可以结束分析，四环素与土霉素在前7 min之内即可出峰，金霉素在12 min出峰。也可看出Fe3O4@SiO2@NIP非分子印迹聚合物液相分析图谱中杂峰较多，但是Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物杂峰较少，体现出了较高的特异性吸附。

图7　加标样品的液相色谱图Fig.7　Liquid chromatograms of spiked samples

表2是在土霉素、四环素添加浓度分别为0.2、0.4、0.8 μg/mL，金霉素添加浓度为0.4、0.8、1.6 μg/mL的情况下测定的加标回收率实验结果。由表2中可以看出，纳米Fe3O4@SiO2@NIP非分子印迹聚合物对肉制品中土霉素、四环素、金霉素药物的平均加标回收率分别为34.63%、32.90%、32.38%；Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物对肉制品中土霉素、四环素、金霉素药物的加标回收率分别为100.08%、93.71%、100.88%，可见，Fe3O4@SiO2@MIP印迹聚合物为吸附剂时回收率略有增大。变异系数在1.54%～7.44%之间，表明设计的残留检测方法可靠，精密度和准确度均可以达到四环素类抗生素残留分析的要求。

依据所建立的实验方案检测鹅胸肉、鹅腿肉、鸭胸肉、鸭腿肉、鲫鱼肉以及牛奶样品中3种四环素类抗生素的残留。检测结果如表3所示，6种样品中四环素类抗生素残留量均低于最大残留量100 ng/g的国家标准要求。

表2　在鹅胸肉中加标回收率实验分析Table 2　Analysis of spiked recovery in geese（n=5）

表3　不同样品中四环素类抗生素检测结果Table 3　The result of detection of tetracycline antibiotics in different samples

2.3.4精密度取1 μg/mL的3种四环素类抗生素的标准混合溶液，在上述色谱条件下，重复进样5次，对先后5次进样所得相应组分峰面积进行差异性比较，结果见表4。相对标准偏差RSD（%）在2.60%以内，表明该方法的重现性较好。

表4　3种四环素类抗生素的精密性实验Table 4　The precision of three tetracycline antibiotics

3　结论

针对四环素类抗生素在复杂样品中吸附特异性偏低和检测时间较长等问题，利用表面分子印迹技术，合成磁性分子印迹复合物，结合固相萃取-高效液相色谱技术，可实现15 min之内同时检测样品中多种抗生素残留。Fe3O4@SiO2@MIP分子印迹聚合物的最大吸附量Qmax为56.28 mg/g，对样品中土霉素、四环素、金霉素药物的平均加标回收率分别达到了100.08%、93.71%、100.88%，变异系数在1.54%～7.44%之间，精密性实验的相对标准偏差在2.60%以内，实验方法准确可靠、重现性良好。大量实验也表明，使用分子印迹技术提高了对目标分子的吸附选择性，为食品中四环素类抗生素污染的监控和治理提供了更完善的快速富集手段。该方法也可推广到其他复杂样品中农兽药的残留分析。

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Magnetic molecularly imprinted nanocompsites combined with solid phase extraction detect tetracycline antibiotic residues

WANG Ya-qun，PAN Dao-dong*
（School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China）

In this study，Fe3O4@SiO2@MIP core-shell nanocomposite was synthesized by surface molecular imprinting technique.It had an ability of selective extraction and detection of tetracycline antibiotics.The magnetic solid-phase extraction combined with high performance liquid chromatography（MSPE-HPLC）detects three kinds of antibiotic residues simultaneously.The magnetic Fe3O4@SiO2@MIP core-shell nanocomposites was characterized by scanning electron microscopy（SEM），transmission electron microscopy（TEM）and Fourier transform infrared（FT-IR）analysis.The result showed that the limit of detection of tetracycline，oxytetracycline and chlortetracycline was 9.61，7.84 and 11.93 μg/kg，respectively；the maximum adsorption capacity of magnetic Fe3O4@SiO2@MIP molecularly imprinted polymers was obtained at 56.28 mg/g，its recoveries ranging from 93.71%to 100.88%were obtained with relative standard deviations in the range of 1.54%～7.44%. Compared with Fe3O4@SiO2@NIP，the selective adsorption of Fe3O4@SiO2@MIP was more capable.

tetracycline antibiotic；Fe3O4nanocomposites；MIP；SPE；HPLC

TS207.5

A

1002-0306（2015）18-0053-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.18.002

2015－01－04

王雅群（1987-），女，硕士研究生，研究方向：食品非法添加物的快速检测，E-mail：443856486@qq.com。

潘道东（1964-），男，博士，教授，研究方向：畜产品加工与质量安全，E-mail：daodongpan@163.com。

国家支撑计划（2012BAK08B01-2）；浙江省公益性项目（2014C32051）。