訾　艳，王常青*，陈晓萌，陈　彤，李小凡，郝志萍，于文娟

（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

具有α-淀粉酶抑制活性的白芸豆多肽的制备及其热稳定性研究

訾艳，王常青*，陈晓萌，陈彤，李小凡，郝志萍，于文娟

（山西大学生命科学学院，山西 太原 030006）

以白芸豆为原料，酶法制备多肽。以α-淀粉酶抑制率为指标，比较酸性、中性和碱性蛋白酶的酶解效果。结果表明：3.350酸性蛋白酶的酶解效果最好。通过加酶量、酶解pH值、酶解温度和酶解时间的单因素试验和正交试验，得到制备白芸豆多肽的最佳工艺条件为：加酶量3 200 U/g、酶解pH 2.2、酶解温度55 ℃、酶解时间60 min，此条件下白芸豆多肽α-淀粉酶抑制率为80.82%。热稳定性研究表明，白芸豆多肽的热稳定性高于α-淀粉酶抑制剂（α-amylase inhibitor，α-AI）粗提液，该多肽在85、90 ℃条件下的α-淀粉酶抑制活性能保持更长时间。凝胶电泳分析表明白芸豆多肽的分子质量为7.53～9.09 ku。

白芸豆清蛋白；α-淀粉酶抑制剂；多肽；α-淀粉酶抑制活性；热稳定性

白芸豆（white kidney bean），生物学名菜豆（Phaseolus vulgaris Linn.），别名四季豆、白腰豆等，在我国云南、贵州、四川等省份种植面积较大。白芸豆中蛋白质含量19.9%～20.0%，脂肪含量1.6%～2.1%，碳水化合物含量37.6%～48. 5%，并含有丰富的Ca、Fe等矿质元素及 VC、VB1、 VB2等维生素［1］。白芸豆蛋白质的必需氨基酸组成符合联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）/世界卫生组织（World Health Organization，WHO）标准模式，是一种营养价值高、容易消化的优质蛋白质资源［2］。近年来的研究表明，白芸豆蛋白质中含有一种天然的α-淀粉酶抑制剂（α-amylase inhibitor，α-AI），其分子质量约为30～40 ku［3-5］，该α-AI可以用于治疗糖尿病和肥胖症［6］等，是降糖、降脂及减肥保健食品和药品的新型原料。但是白芸豆中α-AI的热稳定性不高［7］，直接影响到其生产和应用。目前尚未见到关于制备热稳定性较高的白芸豆 多肽的研究报道。本实验以白芸豆为原料，以α-淀粉酶抑制率为指标，首先筛选出酶解白芸豆α-AI粗提液的最佳用酶，然后对该蛋白酶制备多肽的工艺条件进行优化，最后比较研究α-AI粗提液和多肽的热稳定性，旨在为白芸豆保健食品和药品的开发奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

白芸豆 云南银健食品有限公司。

蛋白质电泳Marker 北京天恩泽基因科技有限公司；胃蛋白酶（3 000 U/g）、3.350酸性蛋白酶（4.5 万U/g） 天津市诺奥科技发展有限公司；537酸性蛋白酶（3.9 万U/g）、木瓜蛋白酶（117 万U/g）、碱性蛋白酶（8.8 万U/g）、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（18.4 万U/g） 广西庞博生物工程有限公司；α-淀粉酶（5 万U/g） 合肥博美生物科技有限责任公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2仪器与设备

DYCZ-23A型电泳仪 北京市六一仪器厂；数显恒温水浴提取器 国华电器有限公司；UV-2600型紫外-可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；卷式微滤膜元件Ⅰ 中科瑞阳膜技术（北京）有限公司；卷式超滤膜元件Ⅱ 北京安德膜分离技术工程有限公司；旋转蒸发仪 上海申升科技有限公司；Thermo MR23冷冻离心机 美国热电公司。

1.3方法

1.3.1蛋白质及多肽含量测定方法

蛋白质含量测定参照GB 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》中的方法进行；多肽含量采用GB/T 22729—2008《海洋鱼低聚肽粉》中的三氯乙酸沉淀法测定。

1.3.2α-淀粉酶抑制率的测定方法

采用Bernfeld法［8］测定白芸豆α-AI粗提液及多肽的α-淀粉酶抑制率。

1.3.3白芸豆清蛋白的提取及α-AI粗提液的制备

取一定量的白芸豆粉，按料液比1∶10（m/V）加入蒸馏水，50 ℃条件下提取3 h，离心取上清液，沉淀物按前述工艺再提取一次，合并两次的上清液，得到白芸豆清蛋白提取液。由于α-AI的分子质量为30～40 ku，因此将白芸豆清蛋白提取液用0.2 μm的滤膜微滤后，再用截留分子质量为50 ku的超滤膜超滤，滤出液再用截留分子质量为10 ku的超滤膜超滤，取截留液即为α-AI粗提液［9］，并测定α-AI 粗提液的等电点［10］。

1.3.4白芸豆多肽的制备与工艺条件优化

于α-AI粗提液中分别加入胃蛋白酶、3.350酸性蛋白酶、537酸性蛋白酶、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶，在各蛋白酶适宜条件下酶解1 h。比较不同蛋白酶酶解产物的α-淀粉酶抑制活性，以α-淀粉酶抑制率最高的酶解产物确定最佳用酶［11］。将α-AI粗提液真空浓缩至一定蛋白质含量，调节至一定pH值，加入一定量已筛选出的最佳蛋白酶，在一定温度下酶解一定时间后灭酶，4 000 r/min离心取上清液即为白芸豆多肽溶液［12］。

以α-淀粉酶抑制率和多肽得率为指标，分别进行加酶量（3 000、3 500、4 000、4 500、5 000 U/g），酶解pH值（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5），酶解温度（35、40、45、50、55 ℃）和酶解时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）单因素试验。由于本实验旨在制备高α-淀粉酶抑制活性的白芸豆多肽，因此在单因素试验基础上，以有利于提高α-淀粉酶抑制率为主要目的，兼顾多肽得率为原则，选取适宜参数范围，拟定酶解多肽的L9（34）正交试验，并对正交试验结果进行验证。

1.3.5白芸豆α-AI粗提液和多肽的热稳定性研究［7］

将白芸豆α-AI粗提液和多肽溶液分别在50、60、70、80、85、90、95 ℃水浴中保温30 min，冷却至室温后测定样品的α-淀粉酶抑制率。再将α-AI粗提液和多肽溶液在85、90 ℃水浴中分别保温5、10、15、20、25、 30 min，冷却至室温后测定样品的α-淀粉酶抑制率。

1.3.6白芸豆清蛋白、α-AI粗提液和多肽的分子质量分析［13］

用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）确定白芸豆清蛋白、α-AI粗提液和多肽的分子质量。分离胶质量分数12%，浓缩胶质量分数5%，考马斯亮蓝R-250染色。将蛋白质标准品的相对迁移率对分子质量的对数作图得到标准曲线，再根据标准曲线的回归方程计算白芸豆清蛋白、α-AI粗提液和多肽的分子质量。

1.4统计分析方法

每个实验重复3 次，剔除异常值，取平均值作为结果。数据用Minitab 15软件进行方差分析。

2　结果与分析

2.1白芸豆α-AI粗提液的等电点测定结果

图1　白芸豆a-AI粗提液的等电点Fig.1　Isoelectric point of α-AI extract from white kidney bean

由图1可知，白芸豆α-AI粗提液在pH 4.4时，离心上清液中蛋白质含量最低，因此α-AI粗提液的等电点为pH 4.4。

2.2制备白芸豆多肽的蛋白酶筛选结果

据文献［14］ 报道，白芸豆α-AI经过链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶水解后会失去其抑制活性，而它对胃蛋白酶的水解有一定的抵抗力，即α-AI经胃蛋白酶水解后，仍能保持一定的活性。为探究白芸豆α-AI被其他蛋白酶水解后能否保持其抑制活性，本实验选择酸性、中性和碱性蛋白酶对α-AI粗提液进行酶解。酶解前的α-AI粗提液的α-淀粉酶抑制率为79.27%，而胃蛋白酶酶解液的α-淀粉酶抑制率为46.94%（表1），3.350酸性蛋白酶酶解液的α-淀粉酶抑制率（74.58%）最高，537酸性蛋白酶酶解液次之。α-AI粗提液经枯草芽孢杆菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶酶解后失去了抑制活性，这与小麦α-AI具有的枯草芽孢杆菌蛋白酶/ α-淀粉酶同效抑制性不同［15］。因此，本实验选用3.350酸性蛋白酶制备白芸豆多肽。

表1　6 种蛋白酶酶解白芸豆α-AI粗提液效果的对比Table1　Comparative effectiveness of six proteases in hydrolyzing white kidney bean to obtain -AI extract

2.33.350酸性蛋白酶制备白芸豆多肽的单因素试验结果

2.3.1加酶量对白芸豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影响

图2　加酶量对白芸豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影响Fig.2　Effect of enzyme dosage on peptide yie ld and α-amylase inhibitory activity

在酶解温度45 ℃、酶解时间1 h、酶解pH 3.0的条件下，加酶量与多肽得率和α-淀粉酶抑制率的关系见图2。随着加酶量不断增大，白芸豆多肽得率缓慢增加，这是因为随着酶量的增加，反应速率随之增大，当底物分子能与酶分子百分之百结合的时候，再增加酶的用量也不会对水解速率有明显的影响［16］。而随着加酶量增大，多肽α-淀粉酶抑制率不断下降，当加酶量＜4 000 U/g时，多肽的α-淀粉酶抑制率处于较高水平。综合考虑两方面因素，选择加酶量为3 500 U/g。

图3　酶解pH值对白芸豆多肽得率和α-淀粉酶抑 制率的影响Fig.3　Effect of pH on peptide yield and α-amylase inhibitory activity

2.3.2酶解pH值对白芸豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影响由图3可知，在加酶量4 000 U/g、酶解温度45 ℃、酶解时间1 h时，随着酶解pH值不断增大，白芸豆多肽得率逐渐降低。这是因为3.350酸性蛋白酶在pH值较低时酶活力较高。当pH＜3.5时，随着pH值增大，多肽α-淀粉酶抑制率逐渐降低，pH＞3.5时，α-淀粉酶抑制率基本不变。综合两方面因素，选取pH 2.5为宜。

2.3.3酶解温度对白芸豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影响

图4　酶解温度对白芸豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影响Fig.4　Effect of hydrolysis temperature on peptide yield and α-amylase inhibitory activity

在加酶量4 000 U/g、酶解pH 3.0、酶解时间1 h的条件下，酶解温度对多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影响见图4。当酶解温度＜50 ℃时，多肽得率随着温度的升高而增大，温度为50 ℃时达到最大，当酶解温度＞50 ℃时，多肽得率略有下降。这是因为当酶解温度较高时，酶分子吸收了过多的能量，引起了维持酶分子结构的次级键解体，导致蛋白酶变性，从而使酶活性减弱或丧失［17］。此外，当酶解温度为40 ℃时，多肽α-淀粉酶抑制率最高，随着温度继续升高，α-淀粉酶抑制率略有下降。综合考虑两方面因素，选择酶解温度为50 ℃。

2.3.4酶解时间对白芸豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影响

在酶解温度45 ℃、酶解pH 3.0、加酶量4 000 U/g时，酶解时间与多肽得率和α-淀粉酶抑制率的关系见图5。酶解时间＜2 h时，随着时间的延长，多肽得率缓慢增大，2 h时达到最大，再延长酶解时间，多肽得率略有下降，这可能是因为多肽又被蛋白酶酶解成氨基酸，因此多肽含量有所下降。而随着酶解时间的延长，α-淀粉酶抑制率不断降低，这可能是因为前期酶解所得活性多肽又会被蛋白酶继续酶解，使多肽中具有α-淀粉酶抑制作用的活性部位的特定结构遭到破坏，从而失去部分抑制活性［18］。酶解时间＜1 h时，多肽的α-淀粉酶抑制率较高。综合考虑两方面因素，选择酶解时间为1 h。

图5　酶解时间对白芸豆多肽得率和α-淀粉酶抑制率的影响Fig.5　Effect of hydrolysis time on peptide yield and α-amylase inhibitory activity

2.4白芸豆多肽制备正交试验结果

综合单因素试验结果，以α-淀粉酶抑制率为指标，进行白芸豆多肽制备的正交试验，结果见表2。

表2　正交试验设计与结果Table2　Orthogonal array design arrangement and experimental results

表3　方差分析结果Table3　Analysis of variance e

由表2可知，制备白芸豆多肽的最佳工艺组合为A1B1C3D2，即加酶量3 200 U/g、酶解pH 2.2、酶解温度55 ℃、酶解时间60 min。在此条件下进行验证实验，白芸豆多肽α-淀粉酶抑制率的平均值为80.82%，高于正交表中的其他组合，由此证明正交试验结果可靠。各影响因素的主次顺序为C＞A＞B＞D，即酶解温度对α-淀粉酶抑制率的影响最大，加酶量和酶解pH值次之，酶解时间的影响最小。方差分析结果（表3）表明酶解温度对白芸豆多肽α-淀粉酶抑制率的影响显著，其他3 个因素的影响均不显著。

2.5白芸豆α-AI粗提液和多肽的热稳定性

2.5.1α-AI 粗提液和多肽对不同温度的热稳定性

图6　6 α-AI粗提液和多肽对不同温度的热稳定性Fig.6　Thermal stability of α-AI extract and polypeptide at different temperatures

由图6可知，白芸豆α-AI粗提液的α-淀粉酶抑制率在温度低于80 ℃时变化不大，受温度的影响较小；此后随着温度的升高，α-淀粉酶抑制率快速下降；当在温度＞85 ℃水浴中保温30 min后，α-AI粗提液完全丧失α-淀粉酶抑制活性，这与张晓琦等［19］的研究结果一致。白芸豆α-AI粗提液的热稳定性略低于小麦［20］和荞麦［21］α-AI的热稳定性。而白芸豆多肽的α-淀粉酶抑制率在温度＜8 0 ℃时缓慢降 低，受温度的影响也较小；在85 ℃保温30 min后，其α-淀粉酶抑制率仅降低7%左右；当在温度高于90℃水浴中保温30 min后，多肽即失去α-淀粉酶抑制活性。结果表明，尽管白芸豆多肽初始的α-淀粉酶抑制活性略低于α-AI粗提液，但其热稳定性相对较好，在高温环境下其α-淀粉酶抑制活性可保持更长时间，有利于工业化应用。

图7　85 ℃条件下加热时间对α-AI粗提液和多肽热稳定性的影响Fig.7　Effect of heating time at 85 ℃ on the stability of α-AI extract and polypeptide

2.5.2α-AI粗提液和多肽在85 ℃条件下随时间变化的热稳定性由图7可知，随着白芸豆α-AI粗提液在85 ℃水浴中保温时间延长，其α-淀粉酶抑制率迅速降低，15 min后，其抑制活性完全丧失。而白芸豆多肽在相同温度下保温，其α-淀粉酶抑制活性缓慢降低，30 min后仅降低7%左右。结果表明，白芸豆多肽在85 ℃条件下的热稳定性明显高于α-AI粗提液。这可能是因为α-AI粗提液的主要成分为蛋白质，而热作用可破坏蛋白质分子的天然结构，让本来处在蛋白质分子内部的疏水性基团暴露出来，这样蛋白质分子间的疏水作用增强，互相聚集形成沉淀，发生不可逆的蛋白质变性，使α-AI粗提液丧失其抑制活性。而多肽由于不具有蛋白质分子的高级结构，所以在加热时较稳定。如大豆多肽就具有无蛋白质变性、加热不凝固等优良性能［22］。

2.5.3α-AI粗提液和多肽在90 ℃条件下随时间变化的热稳定性

图8　90 ℃条件下加热时间对α-AI粗提液和多肽热稳定性的影响Fig.8　Effect of heating time at 90 ℃ on the stability of α-AI extract and polypeptide

由图8可知，白芸豆α-AI粗提液在90 ℃条件下保温5 min后，其α-淀粉酶抑制率仅剩余33.97%，10 min后完全失去抑制活性。而白芸豆多肽在90 ℃水浴中保温5 min后仍具有68.12%的α-淀粉酶抑制率；随着保温时间延长，其α-淀粉酶抑制率逐渐降低；保温25 min后，其抑制活性才完全失去。由此可见，白芸豆多肽在90 ℃条件下的热稳定性高于α-AI粗提液。白芸豆α-AI粗提液和多肽在90 ℃条件下的热稳定明显低于其在85 ℃条件下的热稳定性，这可能是因为对蛋白质变性而言，温度每升高10 ℃，反应速率增加约600 倍［22］，因此α-AI粗提液和多肽在90 ℃时变性更快，保持α-淀粉酶抑制活性的时间更短。

2.6白芸豆清蛋白、α-AI粗提液和多肽的分子质量

电泳分析结果（图9）表明，白芸豆清蛋白共分离出7 条蛋白亚基条带，α-AI粗提液有2 条蛋白亚基条带，将各亚基的相对迁移率带入Marker标准曲线（y=0.785x+ 3.957（R2=0.989））中，计算得出清蛋白各亚基分子质量分别为107.56、97.83、87.80、66.08、52.12、34.98、29.70 ku；α-AI粗提液中蛋白质各亚基的分子质量为34.98、29.70 ku，说明清蛋白经过两次超滤后只保留下了两个蛋白质组分，其中分子质量为34.98 ku的亚基条带颜色很深，与文献［4］中报道的白芸豆α-AI的分子质量36.0 ku很接近，可能是α-AI。与文献报道有一定差异的原因可能是本实验中的白芸豆产地和电泳条件不同所致。将多肽电泳条带上下边界的相对迁移率带入标准曲线，计算出具有α-淀粉酶抑制活性的多肽分 子质量在7.53～9.09 ku范围内。

图9　白芸豆清蛋白、α-AI粗提液和多肽的SDS-PAGE图PAGEFig.9　SDS-PAGE of albumin， α-AI extract and polypeptide from white kidney bean

3　结 论

白芸豆α-AI粗提液的等电点为pH 4.4。通过比较胃蛋白酶、3.350酸性蛋白酶、537酸性蛋白酶、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶对白芸豆α-AI粗提液的酶解效果，最终确定3.350酸性蛋白酶为制备高α-淀粉酶抑制活性多肽用酶。实验结果表明，制备白芸豆多肽的最佳工艺条件为：加酶量3 200 U/g、酶解pH 2.2、酶解温度55 ℃、酶解时间60 min，此条件下白芸豆多肽α-淀粉酶抑制率为80.82%。对白芸豆多肽α-淀粉酶抑制率的影响因素排序为：酶解温度＞加酶量＞酶解pH值＞酶解时间，其中酶解温度对α-淀粉酶抑制率影响显著。本研究制备的白芸豆多肽热稳定性明显高于α-AI粗提液，该多肽的α-淀粉酶抑制活性在85、90 ℃条件下能保持更长时间。由凝胶电泳分析可知，α-AI粗提液共有2 条蛋白亚基，其中分子质量为34.98 ku的亚基为α-AI，具有α-淀粉酶抑制活性的多肽分子质量为7.53～9.09 ku。

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Preparation and Thermal Stability of White Kidney Bean Polypeptide with α-Amylase Inhibitory Activity

ZI Yan， WANG Changqing*， CHEN Xiaomeng， CHEN Tong， LI Xiaofan， HAO Zhiping， YU Wenjuan
（College of Life Science， Shanxi University， Taiyuan 030006， China）

In this study， white kidney bean was used as the raw material to prepare polypeptide with α-amylase inhibitory activity by enzymatic hydrolysis. The hydrolysi s efficiencies of acidic， neutral and alkaline protease for α-amylase inhibitor（α-AI） activity were compared to determine 3.350 acidic protease as the best enzyme. Using combination of single factor and orthogonal array de signs an enzyme dosage of 3 200 U/g， an initial pH of 2.2 and 60 min hydrolysis at 55 ℃ were found to be optimal to obtain th e maximum α-amylase inhibitory rate of 80.82%. White kidney bean polypeptide derived from α-AI extract had higher thermal stability than α-AI extract， and the α-amylase inhibitory activity of the polypeptide could be maintained for a longer time at 85 and 90 ℃. Electrophoretic analysis showed that the molecular weight of white kidney bean polypeptide was 7.53-9.09 ku.

white kidney bean albumin； α-amylase inhibitor （α-AI）； polypeptide； α-amylase inhibitory activity； thermal stability

TS201.1

A

1002-6630（2015）13-0190-06

10.7506/spkx1002-6630-201513035

2014-08-11

訾艳（1990—），女，硕士，研究方向为食品生物技术与功能食品开发。E-mail：892853695@qq.com

王常青（1956—），男，教授，学士，研究方向为食品生物技术与功能食品开发。E-mail：wcq@sxu.edu.cn