周玉利　周青雪

T-SPOT.TB阳性标本抗原ESAT-6和CFP-10相关性的探讨

周玉利周青雪

目的 探讨T-spot.TB阳性标本抗原ESAT-6和CFP-10的相关性。方法 统计2011年1月至2014年7月检测的T-spot.TB阳性的333例结果，分析其中抗原ESAT-6与CFP-10的结果并评价相关性。结果 抗原ESAT-6阳性占98.49%，抗原CFP-10阳性占77.48%，抗原ESAT-6阳性且CFP-10阴性占22.52%，抗原ESAT-6阴性且CFP-10阳性占10.51%，抗原ESAT-6阳性合并CFP-10阳性占66.97%。结论 T-spot阳性标本中，抗原ESAT-6合并CFP-10阳性的比例最高，抗原ESAT-6阳性且CFP-10阴性的比例高于抗原ESAT-6阴性且CFP-10阳性的比例。

结核杆菌T细胞斑点试验 抗原靶蛋白6 滤过蛋白10

早期发现和准确诊断是降低结核病发病率、减少传播机会、控制结核病疫情的关键环节。但是，传统的检测方法存在较多缺陷，不足以满足临床需求。结核杆菌T细胞斑点试验（T-spot.TB）是一项有效的结核辅助诊断手段，其敏感性和特异度均＞95%［1］。在欧洲已经获得批准作为结核感染和结核潜伏感染筛查的重要检测手段［2］。其是应用酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测机体内经结核特异性的RDl区编码A抗原早期分泌性抗原靶蛋白6（ESAT-6）和B抗原培养滤过蛋白10（CFP-10）肽段库刺激后释放γ干扰素的特异性T细胞数量。据此判断是否有结核杆菌感染的可能，本资料针对疑似结核患者T-spot.TB检测阳性结果，进行抗原ESAT-6和CFP-10阳性情况的分析，探讨其相关性。

1　临床资料

1.1一般资料 2011年1月至2014年7月本院333例疑似结核患者，血清标本检测T-spot.TB阳性结果中男179例，女154例；年龄7～76岁，平均年龄（42.6±12.3）岁。

1.2仪器与试剂 Baker生物安全柜，RIVCO C02孵育箱。T-spot.TB试剂盒，淋巴细胞分离液、AIMV、RPMll640、ELISPOT计数仪由上海长征复星公司提供。

1.3方法 （1）T-spot.TB检测：按T-spot.TB试剂盒操作规范进行。采集外周全血，无须空腹，需用肝素/肝素锂/肝素钠抗凝，不得使用EDTA抗凝。采血量要求：＜2岁儿童2～3ml，其他患者4～6 ml，免疫力低下/受抑制患者6～8ml；样本室温（15～25℃）保存与运输，不得冷冻/冷藏；样本采集后4h内送到实验室，8h内完成检测；1周内有输血史或做过PET-CT的患者会影响血液中淋巴细胞的分离，建议2周后再进行检测；运输过程中防止颠簸，避免样本溶血影响结果。（2）操作过程：外周抗凝全血梯度离心分离外周血单个核细胞（PBMCs），结核特异性抗原（ESAT-6/CFP-10）刺激结核特异的效应T淋巴细胞，使其分泌γ-干扰素，效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素与模板预包被的抗γ-干扰素抗体结合并固定在细胞周围，传统的ELISA“双抗夹心法”使抗原抗体结合物显色，形成斑点，根据斑点数判断结果，抗原ESAT-6检测孔为测试孔A，抗原CFP-10检测孔为测试孔B。（3）用ELISPOT计数仪（AID iSPOT Reader spectrum，ZEISS，德国）进行斑点阅读与统计：空白对照孔内斑点数＜10且阳性对照孔内斑点数＞20时视为实验有效。判定标准为当测试孔A或B达到以下标准则判定为阳性结果：空白对照斑点数为0～5个时且（抗原A或抗原B孔斑点数）-（空白对照孔斑点数）≥6，判断为阳性（+）；空白对照斑点数为6～10个时且（抗原A或抗原B孔斑点数）≥2×（空白对照孔斑点数），判断为阳性（+）；若上述标准不符合且阳性质控对照孔正常时检测结果为阴性（-）。若阴性对照孔斑点数≥10或阳性对照孔斑点数＜20时，结果不能确定。

1.4统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以%表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1333例T-SPOT.TB阳性患者抗原ESAT-6与抗原CFP-10统计结果 见表1。

表1　333例T-SPOT.TB阳性患者抗原ESAT-6与抗原CFP-10统计结果［n（%）］

2.2333例T-SPOT.TB阳性患者各科室分布情况 在本院内分泌科、感染科、消化科、呼吸科、儿科的T-spot. TB阳性患者中，抗原ESAT-6阳性CFP-10阳性组，抗原ESAT-6阳性且CFP-10阴性组，抗原ESAT-6阴性且CFP-10阳性组，分别所占各科室总数的比例相近，与全院所占的比例66.97%、22.52%、10.51%相符。

3　讨论

T-spot.TB技术是利用结核杆菌感染者外周血单个核细胞中存在结核特异性T细胞，这些淋巴细胞在受到结核杆菌特异抗原刺激后分泌IFN-γ 而设计的T细胞免疫斑点试验。根据斑点数可以推测体内是否存在对结核杆菌反应的效应T细胞，从而实现对结核杆菌感染进行辅助诊断。T-spot.TB检测采用的MTB特异性抗原为ESAT-6和CFP-10（遗传基因RD1区丢失），其蛋白编码来源于结核分枝杆菌基因中的一个菌种特异性基因片断，被称为RD1，这个基因片段在大部分的分枝杆菌以及所有的环境分枝杆菌（包括卡介苗）中不存在，因此ESAT-6和CFP-10作为抗原有较高的特异性［3］。但M.kansasii（堪萨斯）、M.szulgai（苏氏）、M.marinum（海）、M.gordonae（戈登） 四种分枝杆菌亦存在此两种抗原，T-spot.TB阳性结果有可能是上述分枝杆菌感染引起的。

ESAT-6和CFP-10蛋白是牛分枝杆菌的免疫优势抗原，可诱导宿主特异性CD4+T细胞、CD8+、CTL增殖及IFN-7大量产生，在保护性细胞免疫反应中发挥重要作用，且能介导长期持久的免疫记忆。但是现今T-spot.TB技术处于发展阶段还存在较多不足，该试剂盒在诊断活动性结核病方面的作用尚待确定，目前只能用于检测是否有结核感染，并不能鉴别活动性结核病和结核潜伏感染［4，5］。

总之，测孔 A和检测孔B由于所使用的抗原不同，所引起的细胞免疫反应不完全一致，ESAT-6抗原的灵敏度高于CFP-10抗原。且ESAT-6对潜伏感染检测较为有效，但单独使用检出率较低。两者具有互补性，两者联合检测显著提高检测的灵敏度。ESAT-6抗原和CFP-10检测相关性意义值得更深入研究。

1 Meier T， Eulenbruch HP， Wrighton-Smith P， et al. Sensitivity of a new commercial enzyme-linked immunospot assay （T SPOT-TB） for diagnosis of tuberculosis in clinical.practice. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2005，24（8）：529～536.

2 Alfred A Lardizabal.Interferon-Gamma release assay for detection of tuberculosis infection.US Respiratory Disease，2006，54（6）： 59～61.

3 Kim SH ，Song KH，Choi SJ，et al.Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocompromised patients. Am J Med，2009，122（2）：189.

4 Sztajnbok F R，Boecha N L，Sztajnbek D C，et al.The challenge of pediatric tuberculosis in face of new diagnostic techniques .J Pediatr（Rio J），2009， 85（3）： 189～193.

5 Ariga H，Harada N.Evolution of IGRA researches . Kekkaku，2008，83（9）：641～652.

310006 杭州市第一人民医院检验科