康学东，张瀚文，余臣祖

1.甘肃中医药大学附属医院内分泌科，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

黄金胶囊对2型糖尿病伴胰岛素抵抗大鼠骨骼肌细胞PI-3K、GLUT4蛋白表达的影响

康学东1，张瀚文2，余臣祖2

1.甘肃中医药大学附属医院内分泌科，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

目的：观察黄金胶囊对糖尿病大鼠骨骼肌细胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、葡萄糖转运因子4（GLUT4）表达的影响，探讨其改善胰岛素抵抗的作用机制。方法：采用小剂量链脲佐菌素（STZ）腹腔注射加高热量饲料喂养，制备2型糖尿病（T2DM）伴胰岛素抵抗（IR）大鼠模型，通过免疫组化法观察黄金胶囊对糖尿病各组大鼠体重、血糖及骨骼肌细胞PI-3K和GLUT4蛋白表达的影响。结果：黄金胶囊组大鼠较模型组体重减轻，血糖降低，骨骼肌细胞PI-3K和GLUT4的蛋白表达提高，作用与罗格列酮组相当。结论：黄金胶囊改善T2DM伴IR大鼠体重、降低血糖机制可能与提高骨骼肌细胞PI-3K和GLUT4的蛋白表达有关。

2型糖尿病；胰岛素抵抗；黄金胶囊；罗格列酮

在2型糖尿病的发生、发展过程中胰岛素抵抗作为重要的发病因素与其有着密切的联系。随着现代医学的发展，近年来研究中医药对胰岛素抵抗的干预有了一定的进展。其中尤以黄连的研究最多，其主要成分中小檗碱含量最高，研究发现其具有一定的降血糖作用。同时鸡内金的有效成分鸡内金多糖也同样具有降低血糖、血脂的作用。本课题的前期研究证明，黄金胶囊在大剂量治疗2型糖尿病大鼠时具有明显改善胰岛素抵抗的作用，本研究在前期研究的基础上，进一步研究黄金胶囊改善胰岛素抵抗的分子机制。

1 材料与方法

1.1 动物分组及处理 选用4月龄、雄性SPF级W istar大鼠60只，体重200～250 g，由甘肃中医学院动物实验中心SPF级实验室提供［实验动物质量合格证号：SCXK（甘）2011-0001-0001365，动物实验设施使用证号：SYXK（甘）2011-0001-0000407］。W istar大鼠用普通饲料适应性喂养4周后，按体重编号，查随机数字表抽取10只大鼠为空白组（喂以普通饲料）；其余50只为造模组，均喂以高脂饲料，高脂饲料参考Leng S等［1］稍作修改（其中含胆固醇2%，猪油10%，基础饲料88%），造模组喂养4周后，禁食12 h，将链脲佐菌素（STZ）溶于0.1mm ol/L柠檬酸缓冲液（pH=4.4）中，按剂量50 m g/kg一次性左下腹腔注射，72 h后禁食、不禁水12 h，尾静脉采血，测量大鼠尾静脉空腹血糖（FPG）、餐后2h血糖（OGTT2h），取FPG≥11.0 mm ol/L、OGTT2h≥16.7 mm ol/L的大鼠归入糖尿病模型组。将造模成功大鼠随机分为模型组、罗格列酮组、金胶囊组，各组动物分别灌胃药物或生理盐水（NS），每天1次，给药剂量按人与大鼠体表面积比折算成等效剂量。空白组、模型组分别每天灌胃等剂量的NS（1m L/kg）；罗格列酮组每天灌胃罗格列酮溶液（0.36m g/kg）；黄金胶囊组每天灌胃等体积黄金胶囊溶液（2.025 g/kg）。除空白组外，其余各组均继续喂以高脂饲料10周，并每周称体重。

1.2 试剂与药物 链脲佐菌素（STZ）［Sigm a公司（美国），产品批号：S0130-1G］；罗格列酮（太极集团重庆涪陵制药厂有限公司生产，批号：13010006，规格：4m g）；黄金胶囊（由甘肃中医学院附属医院制剂中心提供，批号：1201101）；瑞特血糖监测系统和试纸条［厂家：华广生技股份有限公司，注册号：国食药监械（许）字2012第2400103号］；磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：11CM 251），葡萄糖转运因子4（GLUT4）免疫组化染色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA1353-1），一抗山羊抗兔免疫组化试剂盒（先北京中衫金桥生物技术有限公司，批号：14188A05）。

1.3 检测方法 喂养10周后尾静脉取血，采用瑞特血糖监测仪和试纸条测定血糖。取大鼠一侧后肢骨骼肌，大小约2mm×15mm×10mm，放于实验前编号的广口瓶中，加入4%多聚甲醛溶液固定，24 h后送病理实验室，常规石蜡包埋、切片（5μm），行免疫组化染色，用BI-2000医学图像分析

系统分析图像，测定PI3K，GLUT4平均光密度。

1.4 统计学方法 数据采用SPSS17.0统计软件处理，计数资料以（±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析及配对T检验。

2 结果

2.1 各组大鼠体重变化比较 见表1。模型组给药后体重与黄金胶囊组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 各组大鼠体重变化比较（±s） g

表1 各组大鼠体重变化比较（±s） g

与模型组相比较，①P＜0.05

组别空白组模型组罗格列酮组黄金胶囊组样本数12 12 12 12给药前247.7±22.83 253.5±25.50 248.6±19.85 250.7±24.53给药后320.8±18.12 418.9±18.90 368.1±17.29 289.8±15.55①

2.2 各组大鼠FPG变化比较 见表2。大鼠经造模后空白组与其余各组FPG比较，差异有统计学意义（P＜0.05），经过药物干预后，模型组FPG与其他用药组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），各药物组均治疗有效。

表2 各组大鼠FPG变化比较（±s） mmol/L

表2 各组大鼠FPG变化比较（±s） mmol/L

与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组别空白组模型组罗格列酮组黄金胶囊组样本数12 12 12 12剂量（mg/kg）等体积NS等体积NS 0.5 20.25给药前4.52±0.48 21.54±2.88①22.45±3.67①22.68±3.42①给药后4.48±0.51 26.47±1.23 12.67±0.87②13.36±1.01②

2.3 各组大鼠OGTT2h变化比较 见表3。大鼠经造模后空白组与其余各组OGTT2h比较，差异有统计学意义（P＜0.05），经过药物干预后，模型组OGTT2h与其他用药组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），各药物组均治疗有效。

表3 各组大鼠OGTT2h变化比较（±s） mmol/L

表3 各组大鼠OGTT2h变化比较（±s） mmol/L

与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05

组别空白组模型组罗格列酮组黄金胶囊组样本数12 12 12 12剂量（mg/kg）等体积NS等体积NS 0.5 20.25用药前4.63±0.46 21.54±2.88①22.45±3.67①22.68±3.42①用药后6.94±0.62 25.98±3.25 12.85±0.67②16.51±1.09②

2.4 各组大鼠骨骼肌组织PI3K、GLUT4蛋白表达比较 见表4、表5、图1、图2。免疫组化染色后的空白组正常骨骼肌组织中棕色区域提示PI3K阳性，棕色染色均匀分布在细胞质及细胞膜上，表达蛋白染色呈深棕色，呈点状，细胞核内阳性染色不明显。模型组中目标蛋白主要分布在细胞膜及细胞质内，阳性染色颗粒数量减少，分布不均匀，颜色呈浅黄色，说明目标蛋白表达明显减弱，相同视野内阳性显色面积较正常骨骼肌组织明显减少。罗格列酮组阳性表达位置不变，相同视野内阳性显色细胞分布不均匀，阳性表达较低于空白组，高于模型组。黄金胶囊组阳性表达特点同罗格列酮组，但阳性表达细胞数量及表达强度低于罗格列酮组，高于模型组。通过切片图像学分析：空白组PI3K、GLUT4蛋白表达与其他各组比较，蛋白表达最强最明显（P＜0.05），模型则呈现低表达，表达强度低于罗格列酮组及黄金胶囊组（P＜0.05），罗格列酮组与黄金胶囊组比较，前者表达强度更强（P＜0.05）。

图1 各组大鼠PI3K蛋白免疫组化图（空白组为A，模型组为B，罗格列酮组为C，黄金胶囊组为D）

图2 各组大鼠GLUT4蛋白免疫组化图（空白组为A，模型组为B，罗格列酮组为C，黄金胶囊组为D）

表4 各组大鼠骨骼肌组织PI3K蛋白表达比较（±s）

表4 各组大鼠骨骼肌组织PI3K蛋白表达比较（±s）

与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与罗格列酮组比较，③P＜0.05

组别空白组模型组罗格列酮组黄金胶囊组样本数12 12 12 12平均光密度0.381±0.012 0.310±0.008①0.370±0.041①②0.353±0.006①②③

表5 各组大鼠骨骼肌组织GLUT4蛋白表达比较（±s）

表5 各组大鼠骨骼肌组织GLUT4蛋白表达比较（±s）

与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与罗格列酮组比较，③P＜0.05

组别空白组模型组罗格列酮组黄金胶囊组样本数12 12 12 12平均光密度0.378±0.009 0.309±0.007①0.364±0.006①②0.351±0.010①②③

3 讨论

向雪松［2］比较了不同实验所用的高脂饲料的构成，指出动物饲料组成猪油占10%、蔗糖占20%这样的配比，易于诱发胰岛素抵抗、造模成功率较高且能使血糖中度升高，是较好的复制2型糖尿病模型的高脂饲料的选择。本研究采用的高脂饲料配比方案来自于模拟2型糖尿病患者的饮食模式进行的高脂饲料的成分配比，其中胆固醇及胆酸盐的添加，无疑是本研究的亮点所在。

现代医学认为，胰岛素通过信号转导调节糖代谢和能量代谢。其中PI3K途径被认为是胰岛素信号转导的经典途径［3］，PI3K途径是胰岛素在靶器官中信号转导的主要通路之一，胰岛素作用的靶器官，在摄取利用葡萄糖时，是经由一步一步蛋白结合，信号激活所传导下去的。即从胰岛素受体到胰岛素受体底物-1，再到PI3K最后传递至GLUT4等一系列的信号转导过程完成的［4］。这一信号转导过程的任何环节障碍均可引起胰岛素抵抗。

目前，许多动物实验和临床研究表明，黄连及其有效成分生物碱对于改善糖尿病及其并发症的各种症状具有明显效果，但其作用机制尚未完全阐明。现今对黄连的研究表明，黄连中的主要成分为小檗碱，研究表明小檗碱可以改善胰岛素抵抗、刺激胰岛素分泌，及降低血脂［5］。小檗碱可以增加肝脏中过氧化物酶增殖体激活受体，同时可上调肝脏胰岛素诱导基因［6］。有研究表明，黄连中所含的生物碱可提高大鼠骨骼肌糖原储存，增加糖尿病大鼠胰岛素底物、GLUT4，从而起到降低血糖的作用［7］。现代对鸡内金的研究表明，鸡内金内含有鸡内金多糖，其可提高糖尿病合并非酒精性脂肪肝大鼠的脾脏指数和胸腺指数，促进淋巴细胞转化，改善其细胞免疫功能，依据对给予鸡内金多糖大鼠的跟踪研究表明，鸡内金多糖可降低空腹血糖水平，同时对血脂有一定的调节作用。在黄金胶囊改善2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性研究中，黄金胶囊可以提高胰岛素敏感指数［8］。

2型糖尿病多系特异性体质人群长期饮食失常（如过食肥甘厚味等）与体力活动减少等共同作用致使人体气化失常、浊毒积聚，进而阻碍气血运行，影响脏腑功能所致，中医治疗2型糖尿病伴胰岛素抵抗从毒浊论治，解毒化浊、调气活血。本实验所用的黄金胶囊，药物组成为黄连、鸡内金。黄连苦寒，清热燥湿，泻火解毒。长期应用损伤脾胃，故佐以鸡内金运脾消食，护胃和中，二药合用，共奏解毒化浊、调气活血之效。

本实验研究表明，黄金胶囊可降低血糖、体重，增加骨骼肌细胞PI3K和GLUT4蛋白表达，效应基本与罗格列酮一致，推测黄金胶囊提高胰岛素敏感性的作用，与激活骨骼肌组织胰岛素信号传导通路中PI3K和GLUT4的蛋白表达有关。

［1］Leng S，Lu FE，Xu L.Therapeutic effects of berberine in im paired glucose tolerance rats and its influence on insulin secretion ［J］.Acta Pharm acologica Sinica，2004，25（4）：496-502.

［2］向雪松.2型糖尿病大鼠模型的建立及其在辅助降血糖功能评价中的应用［D］.北京：中国疾病预防控制中心，2010.

［3］Taha C， Klip A.The insulin signaling pathw ay［J］. JournalofM em brane Biology，1999，169（1）：1-12.

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［6］Zhou JY，Zhou SW，Zhang KB，et al.Chronic effects of berberine on blood，liver glucolipid m etabolism and liver PPARs expression in diabetic hyperlipidem ic rats［J］.BiolPharm Bull，2008，31：1169.

［7］徐颖.黄连总生物碱的提取及其对实验性糖尿病肾病大鼠的保护作用及机制的初步研究［D］.重庆：第三军医大学博士学位论文，2006：36.

［8］崔庆荣.黄金胶囊改善2型糖尿病胰岛素抵抗大鼠胰岛素敏感性研究［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16（5）：150-152

（责任编辑：骆欢欢）

R587.1

A

0256-7415（2015）12-0227-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.12.102

2015-03-30

甘肃省科技厅科技计划项目（1208RJZA179）；甘肃中医药大学中青年科研基金项目（ZQ2014-12）

康学东（1962-），男，主任医师，研究方向：中西医结合治疗糖尿病及其并发症。

余臣祖，E-mail：442940743@qq.com。