周大为

杭州市中医院病理科，浙江 杭州 310007

槐耳颗粒对乳腺癌动物模型Ki67、p53、CerbB-2蛋白表达的影响

周大为

杭州市中医院病理科，浙江 杭州 310007

目的：探讨槐耳颗粒对乳腺癌动物模型Ki67、p53、CerbB-2蛋白表达的影响。方法：通过接种MCF-7、ER+/PR+乳腺癌细胞系构建乳腺癌裸鼠模型40只，随机分为空白对照组（安慰剂，10只）、槐耳颗粒组（30只），肿瘤0.5～1.0 cm后开始给药，均干预21天，用药期间间隔2天测量肿瘤体积1次。处死裸鼠通过免疫组化方法测定Ki67、p53、CerbB-2等蛋白表达。结果：槐耳颗粒组给药7天、14天、21天PR、Ki67、p53、CerbB-2蛋白表达明显低于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：槐耳颗粒能明显降低Ki67、p53、CerbB-2蛋白表达，对乳腺癌肿瘤生长有一定的抑制作用。

乳腺癌；槐耳颗粒；动物模型；蛋白表达

研究证明，Ki67、p53、CerbB-2蛋白参与肿瘤生长、增殖、分化、转移，为此可将上述蛋白表达作为乳腺癌发生、发展评估的重要指标［1］。槐耳颗粒从槐耳菌质中提取，不仅可直接抗肿瘤，而且能增强机体免疫能力。目前，临床关于Ki67等蛋白在恶性肿瘤中表达、槐耳颗粒治疗乳腺癌效果研究较多，但关于槐耳颗粒对乳腺癌Ki67、p53、CerbB-2等蛋白表达影响研究甚少。基于此，本研究通过动物模型对照实验分析槐耳颗粒对Ki67、p53、CerbB-2蛋白表达的影响，以为槐耳

颗粒治疗乳腺癌提供依据，结果报道如下。

1 材料与试剂

1.1 实验动物及细胞株 取40只健康雌性裸鼠（中国科学院上海实验动物中心提供），日龄20～28天，平均（25.5±1.5）天；体重10～15 g，平均（12.5±1.0）g。雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、MCF-7人乳腺癌细胞（上海生博生物医药科技有限公司提供）。

1.2 药物及试剂 鼠抗人一抗、二抗由北京中杉生物技术开发公司提供；p53、Ki-67、CerbB-2等蛋白免疫组化检测试剂盒；槐耳颗粒由启东盖天力药业有限公司生产提供。

2 方法

2.1 细菌培养 MCF-7、ER+、PR+细胞培养环境：10% FCS-RPM I-1640培养液，温度维持37℃，二氧化碳浓度5%，湿度处于饱和状态。

2.2 动物模型建立 ①40只雌性裸鼠SPF环境下饲养，弱酸饮用水消毒灭菌后使用，单独分笼喂养，每天紫外线照射4 h，同时不限制自然光照射。保持裸鼠生活温度23～28℃，湿度40%～60%，饮用水2天更换1次，垫料7天更换1次。②培养细胞处理。生长期细胞胰酶消化停止后4℃环境下离心，转速1000 r/m in，8m in左右，去上清后RPM I-1640培养液离心，温度、转速、时间同上，洗涤2次后于一定量PBS中重新悬浮，保持细胞密度5×105～5×106/m L，冰盒中保存备用。③裸鼠喂养7天后随机分组行MCF-7、ER+/PR+细胞接种，完成后继续喂养一段时间，这个过程中密切观察裸鼠饮食、排便、精神等情况。10天后裸鼠体内肿瘤结节开始形成，肿瘤形成率100%，均纳入实验。

2.3 实验动物分组 随机分为2组：空白对照组（安慰剂）10只，槐耳颗粒组30只，肿瘤直径0.5～1.0 cm后开始给药，20 g槐耳颗粒（主要成分为槐耳菌质）灌胃，根据裸鼠体重变化适当调整用药剂量。用药期间对饮食、饮水不限制，同时加强营养，饮用水、垫料每天更换。定期测定观察裸鼠肿块体积情况。用药21天后处死裸鼠，将瘤块快速取出，甲醛中固定，行免疫组化测定。

3 观察指标与统计学方法

3.1 观察指标 观察记录裸鼠应用槐耳颗粒后不同时间点ER、PR、Ki67、p53、CerbB-2蛋白表达情况，根据着色程度、阳性细胞比例评价免疫组化结果，着色程度分为0分、1分、2分、3分，分别对应无色、浅黄色、棕黄色、棕褐色；阳性细胞比例为＜10%、11%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，对应0分、1分、2分、3分、4分，两种评分相乘判断：阴性-0分（-），弱阳性-1～4分（+），中度阳性-5～8分（++）、强阳性-9～12分（+++或++++）。

3.2 统计学方法 运用SPSS19.0统计软件分析数据，计量资料以（±s）表示，采用t检验。

4 结果

4.1 槐耳颗粒干预前后免疫组化指标变化 见表1。槐耳颗粒组用药不同时间点ER表达与空白对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。槐耳颗粒组用药不同时间点PR、Ki67、p53、CerbB-2蛋白表达较空白对照组降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 槐耳颗粒干预前后免疫组化指标比较

4.2 槐耳颗粒干预后瘤体病理变化情况 见图1～3。槐耳颗粒干预7天、14天、21天瘤体中心变化情况。

图1 干预7天情况

图2 干预14天情况

图3 干预21天情况

5 讨论

有调查显示，我国2003—2009年城市乳腺癌病死率增加约39%，是导致女性死亡的高危因素之一。目前，临床治疗乳腺癌方法较多，包括手术、放化疗、中医药等，但整体上来说乳腺癌术后5年复发转移率高，尤其是术后2年，远处脏器转移占早期复发转移的50%～70%［2］，预后差。为此选择一种有效方案降低乳腺癌复发转移率至关重要。

中医学认为，乳腺癌属乳癖、乳岩等范畴，与肝、脾、胃密切相关，较多医书中提到乳腺癌发生其内因在于正气不足，其外因与外邪入侵、情志不舒致使气血瘀滞、脾胃失和有关。相关报道称，中医药可能是通过对癌细胞生长抑制、阻止诱变物和靶分子结合等对乳腺癌作用［3］。槐耳颗粒主要成分为槐耳菌质（成分单一），槐耳味苦，辛且平，归肝、脾经，具有止血、抗癌功效。动物实验表明，槐耳成分中药能明显延长肿瘤小鼠生命期限，抗肿瘤作用较强。现代药理学研究表明，槐耳能增强巨噬细胞吞噬能力，提高机体免疫能力，同时槐耳对血管内皮细胞增殖、迁移有一定的影响，通过提高溶菌酶活性、增强巨噬细胞功能等以抑制肿瘤细胞株生长［4］。关若丹等［5］通过对照实验表明槐耳颗粒在延长早期乳腺癌患者生存期、降低

其复发转移率有一定的优势。关于槐耳颗粒与乳腺癌研究着重于观察患者复发率及生存时间，而关于槐耳颗粒对乳腺癌肿瘤生长抑制作用机制研究相对少。近年来肿瘤标志物、相关蛋白表达在肿瘤疾病发生、发展、预后评估中起重要作用，如p53、Ki67、CerbB-2等，其中p53为抗癌基因，野生型P53基因对癌细胞生长、分裂及其他癌基因活性有抑制作用。Ki67属于一种抗原，于增殖细胞核基质中存在，对肿瘤细胞增殖活性直接反映，且敏感性高，同时可有效反映增殖细胞数目，临床常用于肿瘤细胞增殖速度测定［6］。CerbB-2是存在于17q21区带上的一种酪氨酸蛋白，密切参与细胞生长，对细胞增殖、分化可有效反映［7～8］。为此通过实验分析槐耳颗粒对乳腺癌细胞p53、Ki67、CerbB-2等蛋白表达的影响，了解槐耳颗粒作用机制，对乳腺癌诊治、预后评估有十分重要的意义。

本研究结果显示，槐耳颗粒组用药后不同时间点Ki67、p53、CerbB-2蛋白表达较空白对照组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），提示槐耳颗粒对Ki67、p53、CerbB-2蛋白表达有明显抑制作用，具体来说，上述蛋白能抑制乳腺癌细胞生长、增殖，且有时间依赖性。临床常认为，药物抗肿瘤作用发育与抗孕激素密切相关，如米非司酮，本研究结果显示，槐耳颗粒组用药后不同时间点PR较空白对照组降低（P＜0.05），这可能与槐耳颗粒对孕激素受体阳性敏感性更高有关，因此用药期间阳性细胞被杀伤，用药后PR阳性率下降。

综上所述，槐耳颗粒可显著降低乳腺癌裸鼠模型Ki67、p53、CerbB-2蛋白表达，抑制乳腺癌肿瘤生长、增殖，这可能是槐耳颗粒对乳腺癌发挥疗效的作用机制，临床值得进一步研究。

［1］郭阿垚，于鹏飞，姚凡，等.新辅助化疗对乳腺癌ER、PR、C-erbB2、p53和Ki67表达的影响［J］.中国医科大学学报，2010，39（12）：1051-1054.

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［8］陈焕清，符少萍，缪瑞明，等.新辅助化疗对乳腺癌CerbB-2、P53、Ki67和Ca15-3表达的影响及意义［J］.中华临床医师杂志（电子版），2011，5（18）：5470-5472.

（责任编辑：刘淑婷）

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0256-7415（2015）12-0224-03

10.13457/j.cnki.jncm.2015.12.101

2015-08-12

周大为（1973-），男，主管技师，研究方向：病理学。