高 萌李明仙李宇赤王婉丽李 光

1.西双版纳傣族自治州医院中药房，云南景洪 666100；2.西双版纳傣族自治州职业技术学院，云南景洪 666100；3.中国医学科学院药用植物研究所云南分所，云南景洪 666100

柱前衍生化法测定丽江产玛咖中18种氨基酸含量

高 萌1李明仙1李宇赤2王婉丽2李 光3▲

1.西双版纳傣族自治州医院中药房，云南景洪 666100；2.西双版纳傣族自治州职业技术学院，云南景洪 666100；3.中国医学科学院药用植物研究所云南分所，云南景洪 666100

目的 测定丽江产玛咖中必需氨基酸的含量。方法 以2，4-二硝基氟苯为衍生试剂，与丽江产玛咖中18种氨基酸柱前衍生，用Waters 600高效液相色谱仪，菲罗门公司Symmetry C18色谱柱，以含1% N，N-二甲基甲酰胺的0.05mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液（pH=6.4）及乙腈∶水（1∶1）进行梯度洗脱，检测波长为360nm，柱温为35℃，进样量为20μL。结果 18种氨基酸的线性回归方程r值为0.9995～1.0000（n=5），平均回收率为99.54%～101.84%，RSD值为0.38%～1.82%，n=6。结论 本法快速、简便，结果准确。

柱前衍生化；玛咖；氨基酸；2，4-二硝基氟苯；高效液相色谱法

Maca（lepidium meyenii walp.，一般音译为“玛咖”）是十字花科（cruciferae）独行菜属（lepidium）一年生或两年生的草本植物，原产于秘鲁海拔3500～4000m左右的胡宁（Junin）和帕斯克（Pasco）狭长地带［1］。玛咖在南美的食用历史已经有5800多年，传统上作为食物和草药，可改善性功能［2］，提高生育力，抗疲劳［3］，抗肿瘤和用于治疗抑郁症、哮喘症和女性更年期综合征等。玛咖中含有丰富的蛋白质、氨基酸、牛磺酸、矿物质锌［4］等与免疫调节相关的化学成分，而且传统上玛咖就具有显著的增强精力的“适应原样作用”［5］。目前，以玛咖为原料的保健食品、食品日益增多［6］，但鲜有相关质量控制方法方面报道，氨基酸作为其保健主要成分，建立成熟的氨基酸测定方法，可为玛咖鉴别、质量控制、商品规格划分提供参考。

大多数氨基酸无紫外吸收和荧光发射特征，为提高分析检测灵敏度和分离选择特性，通常将氨基酸进行衍生化。目前已经报道的用于氨基酸柱前衍生的衍生试剂有多种［7-12］，不同的衍生剂都有各自的不足，而2，4-二硝基氟苯（DNFB）衍生化方法因其试剂价格低廉，操作简便，所得产物相对稳定等优点而被广泛应用，本实验参考文献［13-14］采用该方法柱前衍生化测定丽江玛咖中总氨基酸类成分，同样考察水解因素及衍生化因素对结果的影响，有望为建立玛咖药材质量控制方法提供理论依据。

1　材料与方法

1.1 实验材料

玛咖购自丽江产地；醋酸（分析纯，天津市光复精细化工研究所）；2，4-二硝基氟苯（分析纯，成都格雷西亚化学技术有限公司）；醋酸钠（分析纯，成都格雷西亚化学技术有限公司）；碳酸钠（分析纯，成都格雷西亚化学技术有限公司）；乙腈（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）；氢氧化钠（分析纯，成都格雷西亚化学技术有限公司）；色谱纯乙腈（美国 Fisher公司）；N，N-二甲基甲酰胺（分析纯，成都格雷西亚化学技术有限公司）；苯酚（分析纯，成都格雷西亚化学技术有限公司）；磷酸二氢钾（分析纯，成都格雷西亚化学技术有限公司）；pH为7.0的磷酸盐缓冲液（0.1mol/L氢氧化钠溶液29.1mL溶解0.68g磷酸二氢钾，蒸馏水定容至100mL）；门冬氨酸等氨基酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号为140624-200805）。

1.2 实验仪器

Waters 高效液相色谱仪，Empower色谱工作站（美国沃特世公司）；数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；分析天平（赛多利斯公司）；电子天平（赛多利斯公司）；TGL16M湘智离心机（安徽诚信启动设备有限公司）；酒精喷灯（上饶市教仪厂）。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件 色谱柱：Phenomenex Symmetry C18柱（5μm，4.6×250mm）。 流 动 相：A泵：含1%N，N-二甲基甲酰胺的0.05mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液（pH=6.4）。B泵：乙腈∶水（1∶1）。检测波长：360nm；流速：1mL/min；柱温：30℃。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序表

1.3.2 标准溶液的配制 分别精密称取氨基酸对照品适量，加入蒸馏水定容至50mL，精密量取1mL置安瓿瓶中，加入0.5mol/L碳酸钠溶液混匀，再加入1% DNFB乙腈溶液1mL，震荡，密封于50℃水浴避光反应90min，反应结束后，加入磷酸盐缓冲液定容至10mL，作为对照品溶液。

1.3.3 样品处理 精密称取过3号筛样品0.5000g置于安瓿瓶中，加入10mL含3%苯酚的6mol/L盐酸溶液，密封后于105℃水解22h，反应完成后后80℃水浴蒸干，加入少量蒸馏水超声溶解后定容至10mL。取1mL定容后溶液，按“1.3.2项下”标准溶液配制方法进行反应，反应结束后放置至室温，过0.45μm微孔滤膜，备用。

1.3.4 衍生化条件的优化

1.3.4.1 衍生化试剂用量考察 取1.3.3项中定容后溶液1mL，分别加入衍生化试剂各1、2、3、4、5mL，与60℃衍生化60min，过滤后进样。

1.3.4.2 衍生化时间考察 取1.3.3项中定容后溶液1mL，加入衍生化试剂各2mL，与60℃水浴中分别加热30、60、90、120min，过滤后进样。

1.3.4.3 衍生化温度考察 取1.3.3项中定容后溶液1mL，加入衍生化试剂各2mL，分别在40、50、60、70、80℃水浴中加热60min，过滤后进样。

1.3.5 水解条件的优化

1.3.5.1 盐酸用量考察 精密称取过3号筛样品0.5000g置于安瓿瓶中，分别加入5、10、15mL含3%苯酚的6mol/L盐酸溶液，按“1.3.3项下”方法处理最终定容至10mL。各取1mL溶液加入衍生化试剂2mL，与60℃避光反应60min，滤液采用0.45μm微孔滤膜过滤，备用进样。

1.3.5.2 水解时间考察 精密称取过3号筛样品0.5000g置于安瓿瓶中，按“1.3.3项下”方法处理水解改变为20、22、24h，最终定容为10mL。各取1mL溶液加入衍生化试剂2mL，与60℃水浴中分别加热反应60min，0.45μm微孔滤膜过滤，备用进样。

1.3.5.3 水解温度考察 精密称取过3号筛样品0.5000g置安瓿瓶中，按“1.3.3项下”方法处理水解温度改变为105、100、110℃水解22h，最终定容为10mL。各取1mL溶液加入衍生化试剂2mL，与60℃水浴中分别加热反应60min，0.45μm微孔滤膜过滤，备用进样。

1.3.5.4 苯酚用量考察 精密称取过3号筛样品0.5000g置于安瓿瓶中，加入10mL分别含苯酚0%、1%、3%、5%的6mol/L盐酸溶液，按“1.3.3项下”方法处理最终定容为10mL。各取1mL溶液加入衍生化试剂2mL，与60℃水浴中分别加热反应60min，0.45μm微孔滤膜过滤，备用进样。

2　结果

2.1 衍生化条件优化

以所得色谱图中除衍生化试剂峰外色谱峰峰面积为考察指标，比较不同衍生化条件下对峰面积的影响，结果如图1～3所示。

图1 衍生化试剂用量对峰面积的影响

图2 衍生化时间对峰面积的影响

图3 衍生化温度对峰面积的影响

2.2 水解条件优化

以所得色谱图中除衍生化试剂峰外色谱峰峰面积为考察指标，将1.3.4项下样品进样，比较不同衍生化条件下对峰面积的影响，结果如图4～7所示。

图4 水解温度对峰面积的影响

图5 水解时间对峰面积的影响

图6 盐酸量对峰面积的影响

图7 苯酚浓度对峰面积的影响

2.3 重复性试验

精密量取水解后定容样品溶液1mL，按供试品制备方法进行制备样品，重复进行5次，分别测定样品中各氨基酸峰面积的相对标准偏差。测得RSD范围为0.908%～1.876%，RSD＜2%，说明试验重现性结果良好。

2.4 精密度试验

取“1.3.3项”下供试品制备的样品，连续进样6次，分别计算样品中各氨基酸峰面积的相对标准偏差。测得RSD范围为0.568%～1.962%，说明仪器精密度较好。

2.5 线性关系测定

称取各氨基酸对照品适量，蒸馏水溶解后定容至100mL，分别精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置安瓿瓶中，按“1.3.3项”下方法制备供试品溶液。设置进样量为2μL注入液相色谱仪，选取浓度与峰面积为横纵坐标，计算线性方程，结果见表2。

实验结果表明，各氨基酸对照品进样浓度在上述范围内，峰面积与浓度呈良好的线性关系。

2.6 溶液稳定性实验

精密量取水解后定容样品溶液1mL按“1.3.3项”下方法制备供试品溶液。于0、2、4、6、8h进样，测定5次。除组氨酸RSD为4.825%外，其他氨基酸基本稳定。建议样品溶液制备完后，立即测定。如果保存一段时间测定，应放到凉暗处，此方法制备供试品溶液可以在1h内完成，对样品稳定性要求不高。

表2 氨基酸线性试验结果

2.7 回收率实验

精密称取各氨基酸对照品适量与样品混合，按“1.3.3项”下供试品制备方法进行样品制备。进样后分析各氨基酸回收率。结果表明各氨基酸含量平均值在99.62%～101.13%，RSD在1.03%～1.83%，说明各氨基酸的回收率符合要求。

2.8 样品测定

精密称取丽江玛咖样品0.50g，按照“1.3.3项下”样品制备方法制备进样，所得结果如图8～9及表3所示。

图8 18种氨基酸混合对照品色谱图

图9 丽江产玛咖样品色谱图

表3 玛咖样品中氨基酸保留时间及含量

3　讨论

玛咖作为新资源食品已被广泛认知，保健食品市场逐渐扩大，微量元素及氨基酸可能是其主要的保健功效成分，本文采用DNFB柱前衍生化方法对测定中各氨基酸的含量进行测定，该方法具有反应条件易于控制，操作简便等优点。实验结果发现对氨基酸含量影响较大的衍生化因素为温度与时间，温度过高氨基酸含量降低，可能是由于持续高温会破坏氨基酸结构造成氨基酸结构相互转化，实验中发现尽管反应条件不同，得到各氨基酸间比例变化，但总氨基酸量差异不大也从侧面证实了该观点，本实验参考文献报道［15］在酸水解液中加入苯酚是为了保护色氨酸基团不被破坏，最终确定加入3%含量的苯酚能够达到很好的水解效果，并建议衍生化条件为温度采用2倍量衍生化试剂，于50℃，反应90min。

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Contents of 18 amino acids in MACA using pre-column derivatization method

GAO Meng1LI Mingxian1LI Yuchi2WANG Wanli2LI Guang3
1.Dispensary of Traditional Chinese Medicine，Dai Autonomous Prefecture of Xishuangbanna Hospital， Jinghong 666100，China； 2.Xishuangbanna Vocational and Technical Institute，Jinghong 666100，China； 3.Yunnan Branch， Institute of Medicinal Plant，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Jinghong 666100，China

Objective To analyze the contents of 17 amino acids in MACA using pre-column derivatization method. Methods The amino acids in MACA were pretreated with 2，4-dinitro-fluorobenzene and their derivatives were analyzed on Waters 600 HPLC using Symmetry C18column. Gradienteluents consisted of sodium acetate solution（pH=6.4） with 1% N，N-dimethylformamide， acetonitrile and water（1∶1）. The Detection wavelength was 360nm and column temperature was 35℃. Results The calibration curves for 18 amino acidshad good linearity（r=0.9995～1，n=5）. The mean recoveries of 18 amino acids were 99.54%-101.84% with RSD 0.38%-1.82%（n=6）. Conclusion The method is quick， simple for the content analysis of the amino acids in the injections.

Pre-column derivatization；MACA；Amino acids；DNFB； HPLC

Q517

A

2095-0616（2014）06-33-05

2013-12-11）

中央级公益性科研院所基本科研业务专项（YZYN-11-03）；中国医学科学院北京协和医学院青年科研基金项目（XHYN-01，3332013081）。