李 强， 王九江， 罗水发， 朱俊杰

(宁波明州医院泌尿外科，浙江宁波 315000)

膀胱癌是我国临床泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，同时也是全身10大常见的肿瘤之一［1］。虽然化疗和新辅助化疗在膀胱癌的治疗中已得到了广泛的应用，但是膀胱癌的预后尤其是已发生临床转移和肿瘤复发的患者仍不十分理想［2］。研究表明多基因调控导致其表达产物改变是膀胱癌侵袭和转移的机制之一［3］。近年来发现ATP结合盒转运蛋白E亚族成员 1(ATP-binding cassette，sub-family E，member 1，ABCE1)在肿瘤发生、发展中发挥着重要的作用，ABCE1的异常表达可能与恶性肿瘤的增殖、转移有关［3-4］。本研究通过RNA干扰技术沉默人膀胱癌T24细胞的ABCE1基因，探讨其对膀胱癌细胞生物学行为的影响，为膀胱癌针对ABCE1基因的靶向治疗提供了实验基础。

材料和方法

1 主要材料

人膀胱癌T24细胞株和胎牛血清(上海研晶生物科技有限公司);MI 1640培养液、胰蛋白酶(Gibco);脂质体转染试剂LipofectamineTM2000(Invitrogen);RNA提取试剂Trizol(北京天根公司);cDNA合成试剂盒(TOYOBO);RT-PCR两步法试剂盒(Promcga);siRNA片段(珠海英平生物技术有限公司构建);HRP标记的羊抗鼠IgG(Santa Cruz);鼠抗GAPDH单克隆抗体(上海微蒙生物科技有限公司);CCK-8(上海炎彬化工公司);550酶标仪(Bio-Rad);Matrigel(BD);流式细胞仪(Coulter);生物倒置显微镜(Olympus);ECL试剂盒(Thermo)。

2 方法

2.1 siRNA设计、合成及转染 根据参考文献［5］设计靶向人类 ABCE1的 siRNA序列，正义链为5’-ATCCGCTACAGCGAGTACGTTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTAAACGTACTCGCTTAGCTTTTTTG-3’，反义链为5’-AATFCAAAAAAGCTACAGCGAGTACGTTTACCCCATCTGTGGCTTCACAGGTAAACGTACTCGCTGTAGCG-3’;阴性对照siRNA正义链为5’-GATCCGCGAGACCTCAGTATGTTACCTGTGAAGCCACAGATGGGGTAACATACTGAGGTCTCGCTTTTTTG-3’，反义链为 5’-AATTCAAAAAAGCGAGACCTCAGTATGTTACCCATCTGTGGCTTCACAGGTAACATACTGAGGTCTCGCG-3’;质粒由珠海英平生物技术有限公司构建。膀胱癌细胞株T24细胞培养于含10% 小牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2密闭式孵箱内培养、传代，实验时取对数生长期的细胞。按每孔2×105个将膀胱癌细胞株T24接种于6孔板中，当融合率达80%时以脂质体法进行转染。转染时分为3组:转染 pGenesil-1-ABCE1-siRNA载体者为 T24/ABCE1-siRNA组(实验组)，转染NC siRNA载体者为T24/control组(即对照组)，未转染的膀胱癌T24为T24组(即空白组)。于转染后48 h进行RNA干扰效应的检测。

2.2 RT-PCR检测mRNA表达水平 T24弃培养液后，用PBS冲洗3次，采用TRIzol法提取细胞的总RNA，通过cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA。分别扩增ABCE1和内参照GAPDH。ABCE1的上游引物为 5’-TTGGTTGTGGGAAGTCGT-3’，下游引物为5’-GCTTATGTAGTTAATGGGAGGT-3’(扩增产物为415 bp);GAPDH的上游引物为5’-GAGTCAACGGATTGGTCGT-3’，下游引物为 5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’(扩增产物为185 bp)。PCR反应条件为95 ℃5 min;95 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，共40个循环。通过2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，紫外灯下观察电泳结果，通过UVI凝胶成像系统摄像，Image-Pro Plus 8.0软件分析条带灰度值，用ABCE1/GAPDH为ABCE1的mRNA相对表达量。

2.3 Westem blot检测ABCE1的蛋白水平 T24弃培养液后，以PBS冲洗3次，加入150 μL RIPA裂解液，提取总蛋白，BCA法测定蛋白质浓度，于 99℃变性10 min。取 50 μg蛋白经 10%的 SDS-PAGE后，电转移印迹于PVDF膜上，通过5% 的脱脂奶粉进行封闭，2 h后加入1∶1 000稀释的ABCE1多克隆I抗，4℃过夜，TBST洗膜5 min 5次，加入1∶5 000 HRP标记的 II抗和GAPDH，于37℃孵育2 h。PBS洗涤，通过ECL法检测。暗室曝光X光片，通过UVI凝胶成像系统摄像，Image-Pro Plus 8.0软件分析条带灰度值，以ABCE1/GAPDH为ABCE1的相对表达量。

2.4 流式细胞术检测细胞周期 收集3组T24细胞，调整细胞浓度至1.5×106/L，冷PBS洗涤2次，用70%的冷乙醇(4℃)进行细胞沉淀后混匀备用，洗涤细胞后，再用PBS调细胞浓度为1.5×106/L，与含50 mg/L RNA酶的Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)共同孵育30 min。以100 mg/L碘化丙啶行细胞DNA染色，暗室中放置1 h后，采用流式细胞仪分析各组T24细胞的DNA含量分布，并计算出每个周期细胞所占的百分率。

2.5 CCK-8法检测细胞增殖 指数生长期T24细胞接种于96孔板，调整细胞密度每孔达到1×103，加入含10%胎牛血清DMEM培养基200 μL，每组设6个复孔，培养24 h后，每孔加入CCK-8试剂20 μL，培养箱温育4 h后，以不加细胞空白孔为对照，用酶标仪检测490 nm处的吸光度A值。以细胞的吸光度A值平均值为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。

2.6 细胞划痕损伤实验 在对数生长期将将上述3组T24细胞分别以每孔5×103个的密度接种于6孔板，待培养的各组细胞生长为细胞单层后，通过10 μL移液枪头在单层细胞上呈“一”字划痕。PBS轻柔洗涤，每孔加入2 mL不含胎牛血清的DMEM培养液继续培养，于48 h后倒置显微镜100倍下观察细胞迁移情况。

2.7 Transwell小室侵袭实验 于聚碳酸酯微孔滤膜表面铺Matrigel每孔50 μg，于聚合好的小室下室中加入10%的胎牛血清做条件培养液，在上室加入按上述3种细胞处理过的T24细胞悬液100 μL(细胞总数为3×105/L)，置于培养箱中24 h后取出，以棉签小心刮除滤膜上室面未穿过的瘤细胞，95%的乙醇固定5 min，PBS轻轻漂洗3遍，苏木精染色10 min，PBS冲洗小室，自然晾干，将上室的聚碳酸酯滤膜沿边缘用手术刀片小心取下，通过树脂胶固定于玻片上(膜内面朝上)后，封片;干燥后于200×光镜下记数每膜上、下、左、右、中5个视野的侵袭细胞数，每组平行设3个小室，重复3次，计算平均值为细胞数。

3 统计学处理

采用SPSS 18.0软件行统计学分析，以均数±标准差(mean±SD)表示计量资料，多组间连续变量比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 siRNA抑制ABCE1 mRNA的表达

ABCE1 mRNA表达的RT-PCR检测与对照组和空白组比较，ABCE1-siRNA组条带明显变窄，与对照组和空白组比较，差异均有统计学意义(P ＜0.05)，见图1。

Figure 1.Effect of ABCE1 gene silencing on the mRNA expression of ABCE1 in T24 cells detected by RT-PCR.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs control and blank.图1 RT-PCR检测T24细胞中ABCE1 mRNA的表达

2 siRNA抑制ABCE1蛋白的表达

与对照组和空白组比较，ABCE1-siRNA组蛋白条带明显变窄，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.Effect of ABCE1 gene silencing on the protein expression of ABCE1 in T24 cells detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P ＜0.05 vs blank and control.图2 Western blot检测T24细胞中ABCE1的蛋白表达水平

3 ABCE1基因沉默对细胞周期的影响

流式细胞术检测各组T24细胞的细胞周期，结果示ABCE1-siRNA组与对照组和空白组相比，在G0/G1期的细胞显著增加，在S期细胞显著减少。差异有统计学意义(P＜0.05)，M期细胞数未见明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。说明有明显的S期阻滞，见表1。

4 ABCE1基因沉默对细胞增殖的影响

依CCK-8法检测结果绘制的生长曲线示，ABCE1-siRNA组较对照组和空白组的曲线明显降低(P ＜0.05)，见图 3。

Figure 3.The growth curve of the T24 cells with different treatments.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs blank and control.图3 ABCE1 siRNA对T24细胞生长的影响

5 细胞划痕损伤实验结果

48 h后ABCE1-siRNA组细胞划痕愈合缓慢，而对照组和空白组细胞划痕已基本长满，见图4。

6 ABCE1基因沉默对T24细胞体外侵袭力的影响

如图5所示，对照组和空白组穿过滤膜的细胞数量较多，分别为 56.57 ±5.34 和 57.46 ±4.21，ABCE1-siRNA组穿膜细胞数明显减少(P＜0.05)，实验结果表明特异性干扰ABCE1基因表达可有效地降低T24细胞的侵袭力。

讨 论

膀胱癌的发病率居我国男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第1位，50～69岁为高发年龄，是源自膀胱移行上皮细胞的恶性肿瘤。其具有较易复发、生物学行为复杂多变、易侵袭和转移的特点［4-5］。膀胱癌细胞临床上的远处转移是机体一个多因素、多阶段、多步骤的复杂过程。肿瘤的发生、发展是一个多阶段的逐步演变过程，细胞通过一系列进行性改变而向恶性方向进展［6］。这期间涉及多个基因的变化，既有原癌基因激活和高表达的发生，也包含抑癌基因及凋亡基因的失活，亦还涉及大量细胞周期调节基因功能的变化［7-9］。同时许多研究显示在肿瘤演变向恶性发展过程中存在一种调控分子在控制这些基因的表达变化，进而影响肿瘤的发生发展。相关研究提示ABCE1基因就是这么一种新的“调控分子”，参与了肿瘤的形成和发展。

Figure 4.The results of wound-healing assay.图4 细胞划痕损伤实验结果

ABCE1基因是ATP结合盒转运蛋白E亚家族的成员之一，定位于常染色体的4q31上，编码核糖核酸酶 L(ribonuclease L，RNase L)抑制因子［10］，具有高度的保守性。该蛋白可以阻断干扰素介导的细胞抗病毒2-5A/RNase L的通路，抑制细胞的凋亡过程，并能够在促进蛋白质合成及细胞增殖分化方面发挥作用［11］。有研究表明，在肿瘤细胞系中抑制ABCE1的表达可明显阻碍肿瘤细胞的生长［12-13］，提示ABCEl的表达与肿瘤细胞的发生、发展密切相关，理论上阻断肿瘤细胞中ABCE1的表达可起到治疗肿瘤的作用。

Figure 5.The results of Transwell invasion assay.图5 Transwell小室侵袭实验结果

越来越多的证据表明，ABCE1与肿瘤细胞的生长调控和迁移侵袭密切相关。为了研究ABCE1基因在膀胱癌细胞迁移中的具体作用，本研究使用RNA干扰技术沉默了膀胱癌T24细胞ABCE1基因的表达后，细胞的生长速度明显减慢，迁移能力显著下降，ABCE1基因沉默后S期细胞数明显减少，细胞被阻滞在G0/G1期。同时划痕实验和小室侵袭实验表明ABCE1基因沉默后膀胱癌T24细胞的迁移能力和侵袭能力降低。与Zhao等［14］对肺癌95-D/NCI-H446细胞的研究结果相同。

总之，ABCE1基因不仅与膀胱癌细胞的迁移能力和侵袭能力变密切相关，而且在促进膀胱癌细胞增殖方面也起着重要作用。特异性干扰ABCE1基因表达能够抑制膀胱癌T24细胞的迁移能力，并抑制肿瘤细胞的增殖，因此，ABCE1的siRNA序列可能成为治疗膀胱癌的有效靶点。干预ABCE1可能会为临床膀胱癌等恶性肿瘤的治疗提供新的思路。

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