刘 阳， 李军亮， 许新科， 邝崑琦， 翁胤仑， 陈 伟， 陈 程， 李方成，△

(1中山大学孙逸仙纪念医院神经外科，2广州市妇女儿童医疗中心神经外科，广东广州 510120)

胶质母细胞瘤是成人最常见的原发性中枢神经系统恶性肿瘤，恶性程度最高;具有高度异质性和侵袭性，与正常组织分界不清，手术难以全部切除，同时对术后放、化疗不敏感，易复发，预后极差，中位总体生存时间约为14.6月［1］。

谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases，GPxs)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶，能够有效清除代谢中产生的过多的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，减轻细胞氧化损伤，两者在维持机体内氧化-抗氧化平衡中发挥着重要的作用［2］。谷胱甘肽过氧化物酶1(glutathione peroxidase 1，GPx1)作为谷胱甘肽过氧化物酶族中最多见的抗氧化酶，能有效清除脂质氢过氧化物和其它活性氧化物，在多个肿瘤中如乳腺癌、肺癌、前列腺癌均出现高表达，并能促进细胞的增殖、迁移和侵袭能力［3-5］。GPxs的异常高表达能清除某些肿瘤药物诱导产生的 ROS 而出现耐药［6］。研究［7-8］报道 GPx1在胶质瘤中也同样出现不同程度异常表达，并能影响胶质瘤细胞氧化应激反应状态。同时，脑胶质瘤的发生可能与ROS引起细胞DNA损伤，导致遗传信息的变异有关［9-10］。目前尚无GPx1影响胶质瘤细胞增殖及侵袭能力方面的研究，我们推论通过针对GPx1诱导改变机体内氧化还原反应状态可能成为一种新治疗脑胶质瘤的辅助方法。故本研究通过合成小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)和构建、鉴定 pcDNA3.1-GPx1重组质粒下调和上调GPx1，探讨其对人胶质母细胞瘤细胞株U87MG和U118MG的细胞活力、迁移和侵袭的影响，可为个体化诱导氧化还原反应状态、辅助治疗胶质瘤提供新的实验依据。

材料和方法

1 主要试剂

人胶质母细胞瘤细胞株U87MG和U118MG购于ATCC;DMEM、MEM细胞培养液购自Gibco;胎牛血清购自BI;羊抗兔IgG II抗、细胞增殖检测盒MTS和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒购自Sigma;兔抗人GPx1单克隆抗体购自CST;转染试剂LipofectamineTM2000购自Invitrogen;RIPA组织细胞裂解液购自碧云天公司;Matrigel胶购自BD;Transwell小室购自Costar;细胞RNA提取试剂盒、实时荧光定量逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购自TaKaRa。

2 siRNA的设计、合成和pcDNA3.1-GPx1重组质粒的构建、鉴定

选取特异性 GPx1序列正义链为5’-GGUACUACUUAUCGAGAAUTT-3’，反义链为 5’-AUUCUCGAUAAGUAGUACCTT-3’;阴性对照序列正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反义链为 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。将扩增克隆的GPx1基因片段按照产品说明与载体pcDNA3.1(Invitrogen)连接，构建成重组质粒。克隆序列经测序证实正确，可用于后续实验。以上序列均由上海吉玛制药公司完成。

3 实验方法

3.1 细胞培养、分组及 siRNA和 pcDNA3.1-GPx1的转染 将U118MG细胞和U87MG细胞分别置于含10%小牛血清DMEM和MEM培养液中，于5%CO2、37℃湿度条件下培养。实验分为空白对照(blank control，Ctr)组(加转染试剂)、阴性对照(negative control，NTC)组(加入非特异性siRNA及转染试剂、非特异性pcDNA3.1-GPx1及转染试剂)、特异干扰组(加入GPx1-siRNA及转染试剂、特异性pcDNA3.1-GPx1及转染试剂)。取对数生长期细胞，用胰酶消化调节细胞浓度后接种于35 mm细胞培养皿中。待细胞生长至70% ～80%时，按照脂质体Lipofectamine 2000转染试剂盒操作步骤分别对U87MG细胞和U118MG细胞进行siRNA和pcDNA3.1-GPx1转染。继续培养6～8 h后换液，根据实验需要收集细胞。

3.2 Real-time PCR检测GPx1 mRNA的表达 提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA。采用real-time PCR法。反应体系20 μL。逆转录反应条件为:37℃ 15 min;85℃ 60 s。实验重复3次，以β-actin为内参照计算相对表达量(relative quantity，RQ)。GPx1引物序列正义链为 5’-AAGGTACTACTTATCGAGAATGTG-3’，反义链为 5’-GTCAGGCTCGATGTCAATGGTCTG-3’;β-actin引物序列正义链为5’-GGGTGTGGCACAGCTAGTTCCG-3’，反义链为 5’-CATTGTCAAGTGACGATCACAG-3’。

3.3 Western blotting检测GPx1蛋白的表达 转染后72 h，用PBS漂洗细胞3遍。收集细胞，用组织蛋白裂解液裂解细胞，置于冰上30 min，以12 000 r/min速率离心20 min。取上清20 μL，加入等体积的4×上样缓冲液振荡，煮沸10 min。用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定总蛋白浓度。定量后上样，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，100 V电泳溴酚蓝至凝胶底部。200 mA恒流2 h后，将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭液于常温封闭1 h，TBST漂洗3次，加人兔抗人 GPx1单抗(1∶1 000)，孵育过夜，用TBST洗膜3次。加 II抗，于室温孵育1 h。TBST洗膜，显色。

3.4 MTS实验检测细胞活力 转染后24 h细胞经消化处理，配置为2×107/L浓度的细胞悬液，然后分别接种于96孔板，剂量为100 μL/孔，每组均设5个复孔。同时设置试剂组，不加任何细胞。观察细胞完全贴壁后，分别于 24 h、48 h、72 h加入 20 μL MTS试剂，继续培养4 h，酶标仪于490 nm处测定吸光度值(A值)。按下列公式计算细胞活力抑制率(inhibitory rate，IR)=［对照组A值－实验组A值］/对照组A值×100%;细胞活力促进率(promoting rate，PR)=［实验组A值－对照组A值］/对照组A×100%。

3.5 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 将饥饿的细胞消化收集并计数，按每个小室5×104个细胞接种，上室中为含细胞的无血清的DMEM/MEM培养基，下室加入600 μL含10%血清的 DMEM/MEM培养基，常规培养12 h，取出Transwell小室，用4%多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色，棉棒擦净未穿透微孔滤膜的上室细胞，100倍倒置显微镜下随机选择5个视野，计数视野中的细胞数，以穿膜的细胞数表示细胞的迁移能力。制备无血清DMEN/MEM培养基与Matrigel胶1∶9比例稀释的胶，每个小室铺100 μL胶，4 h后吸出并将饥饿的细胞消化收集并计数，按每个小室1×105个细胞接种，上室中为含细胞的无血清的DMEM/MEM培养基，下室加入600 μL含20%血清的DMEM/MEM培养基，常规培养24 h，取出Transwell小室，后续操作同前，以穿膜的细胞数表示细胞的侵袭能力。按下列公式计算迁移抑制率(%)=(对照组迁移细胞数－实验组迁移细胞数)/对照组迁移细胞数×100%;迁移促进率(%)=(实验组迁移细胞数－对照组迁移细胞数)/对照组迁移细胞数×100%。侵袭计算方法同前。

4 统计学处理

数据用均数±标准差(mean±SD)表示。应用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析或t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Real-time PCR检测 U87MG、U118MG细胞GPx1 mRNA表达的情况

U87MG细胞的GPx1 mRNA表达量较内参照β-actin的表达升高约7.60±3.21倍，说明U87MG细胞的GPx1 mRNA含量呈高表达(P＜0.05)。同时U118MG细胞GPx1 mRNA表达量较β-actin升高约1.26±0.50倍，但差异无统计学意义，说明经转染处理后，U118MG细胞的GPx1 mRNA含量呈低表达，见图1。

Figure 1.mRNA expression of GPx1 in U87MG cells and U118MG cells detected by real-time PCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs U118MG.图1 Real-time PCR检测U87MG和U118MG细胞GPx1 mRNA的表达情况

2 Western blotting检测转染后U87MG、U118MG细胞GPx1蛋白表达的情况

siRNA转染72 h后U87MG细胞的GPx1蛋白表达明显低于对照组及阴性对照组，说明经转染处理后，U87MG细胞的GPx1蛋白含量明显降低(P＜0.05)。同时pcDNA3.1-GPx1重组质粒转染72 h后U118MG细胞GPx1蛋白表达明显高于对照组及阴性对照组，说明经转染处理后，U118MG细胞的GPx1蛋白表达明显升高(P＜0.05)，见图2。

Figure 2.The protein expression of GPx1 in U87MG cells and U118MG cells interfered with the siRNA or pcDNA3.1 detected by Western blotting.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs blank control group(Ctrl)or negative control group(NTC).图2 Western blotting检测siRNA作用U87MG细胞和pcDNA3.1作用U118MG细胞后GPx1蛋白的表达情况

3 MTS实验检测细胞活力的变化

siRNA下调组24 h、48 h、72 h细胞活力抑制率分别为25.9%、35.7%、34.8%。siRNA组 U87MG细胞活力较空白对照组和阴性对照组明显降低(P＜0.05)。质粒上调组24 h、48 h、72 h细胞活力促进率分别为22.7%、45.8%、39.8%。质粒组U118MG细胞的活性较空白对照组和阴性对照组明显升高(P ＜0.05)，见表1～2。

表1 siRNA下调GPx1对U87MG细胞活力的影响Table 1.The effect of down-regulating the expression of GPx1 by the specific siRNA on the activity of U87MG cells(Mean±SD.n=3)

表2 质粒上调GPx1对U118MG细胞活力的影响Table 2.The effect of up-regulating the expression of GPx1 by pcDNA3.1-GPx1 on the activity of U118MG cells(Mean±SD.n=3)

4 Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力

siRNA转染后，U87MG细胞的迁移和侵袭能力明显下降，各组穿膜细胞数与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，细胞迁移抑制率为41.6%±8.2%，细胞侵袭抑制率为40.4% ±10.1%;质粒转染后U118MG细胞的迁移和侵袭能力显著升高，各组穿膜细胞数与对照组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，细胞迁移促进率为55.8% ±9.8%，细胞侵袭促进率为60.8% ±9.2%，见图3、4及表3、4。

Figure 3.The effect of down-regulating the expression of GPx1 by the specific siRNA on the migration and invasion of U87MG cells(×40).图3 siRNA下调GPx1基因对U87MG细胞的迁移与侵袭能力的影响

Figure 4.The effect of up-regulating the expression of GPx1 by pcDNA3.1-GPx1 on the migration and invasion of U118MG cells(×40).图4 质粒上调GPx1基因对U118MG细胞的迁移与侵袭能力的影响

表3 siRNA下调GPx1对U87MG细胞迁移与侵袭能力的影响Table 3.The effect of down-regulating the expression of GPx1 by the specific siRNA on migration and invasion of U87MG cells(Mean±SD.n=3)

表4 质粒上调GPx1对U118MG细胞迁移与侵袭能力的影响Table 4.The effect of up-regulating the expression of GPx1 by the pcDNA3.1－GPx1 on migration and invasion of U118MG cells(Mean±SD.n=3)

讨 论

胶质母细胞瘤的治疗仍以手术切除为主，同期放化疗或其它治疗为辅，但因其高度侵袭性和异质性决定任何单一的治疗方法都有一定的局限性，探索新的治疗方法迫在眉睫［11］。

研究结果发现，与对照组相比上调GPx1表达后U118MG细胞的活力、迁移和侵袭能力均有促进作用;相反的，下调 GPx1的表达后U87MG细胞的活力、迁移和侵袭均有抑制作用。由上述结果可以看出GPx1的表达状态对胶质母细胞瘤细胞的活力、迁移和侵袭能力有着明显的调控作用，具体机制仍然不清楚。生理情况下，机体内的自由基能够通过浓度改变引起细胞氧化应激反应诱导细胞凋亡、坏死的功能，调节着机体细胞的生死平衡［12-13］。研究发现GPxs、ROS的异常表达常与肿瘤的发生、发展有着密不可分的关系［2-3，10］。Szatrowski等［14］研究发现肿瘤细胞较正常细胞产生更多的活性氧化物或其中间产物，以致肿瘤变异，损伤局部正常组织，向周围组织侵袭，发生转移。可能是高表达的GPx1过多清除活性氧簇，降低了ROS对本就比正常细胞耐受的高应激状态的肿瘤细胞的杀伤效应，同样有研究指出低浓度的ROS能够激活转录因子以及促进肿瘤细胞增殖和分化［13］。胶质瘤的侵袭是一个多步骤的复杂过程，包括肿瘤细胞黏附，细胞外基质降解及细胞移动等，细胞外基质的降解是关键。基质金属蛋白酶2和尿激活型纤溶酶原在恶性胶质瘤中表达，均介导细胞周围基质蛋白的降解，均与胶质瘤的侵袭性和血管生成有密切关系［15-16］。研究发现高表达GPx1的肿瘤细胞中伴有基质金属蛋白酶2和尿激酶型纤溶酶原激活因子蛋白的表达升高［4］。推测其可能通过激活基质金属蛋白酶2和尿激酶型纤溶酶原激活因子通路促进细胞迁移和侵袭。

本研究结果发现，siRNA组细胞迁移抑制率为40% ～50%，细胞侵袭抑制率为40% ～50%;质粒上调组细胞迁移促进率为50% ～60%，细胞侵袭抑制率为50%～70%。可见GPx1的表达对胶质母细胞瘤的迁移和侵袭能力影响显著。siRNA下调GPx1后对24 h、48 h、72 h细胞生长抑制率为25% ～35%，同时质粒上调组24 h、48 h、72 h细胞增殖促进率20% ～40%。相较而言，下调GPx1抑制胶质瘤细胞增殖效果不理想，考虑可能因为胶质母细胞瘤细胞高氧化应激耐受。也可能因为硫氧化还原蛋白还原酶在恶性肿瘤细胞中高表达，对肿瘤的生长有着重要的作用［10］。望能够通过后续研究验明作用机制后可以提高其有效性。

综上，本研究结果表明通过小干扰RNA成功下调GPx1表达，能够抑制胶质母细胞瘤细胞的生长，并显著抑制细胞迁移和侵袭能力，对临床上抑制胶质母细胞瘤的生长，特别是肿瘤转移的治疗有着重要的意义。

［1］ Wen PY，Kesari S.Malignant gliomas in adults［J］.N Engl J Med，2008，359(5):492-507.

［2］ Arthur JR.The glutathione peroxidases［J］.Cell Mol Life Sci，2000，57(13-14):1825-1835.

［3］ Lubos E，Loscalzo J，Handy DE.Glutathione peroxidase-1 in health and disease:from molecular mechanisms to therapeutic opportunities［J］.Antioxid Redox Signal，2011，15(7):1957-1997.

［4］ Piantoni P，Wang P，Drackley JK，et al.Expression of metabolic，tissue remodeling，oxidative stress，and inflammatory pathways in mammary tissue during involution in lactating dairy cows［J］.Bioinform Biol Insights，2010，4:85-97.

［5］ Ho JC，Chan-Yeung M，Ho SP，et al.Disturbance of systemic antioxidant profile in nonsmall cell lung carcinoma［J］.Eur Respir J，2007，29(2):273-278.

［6］ Lee HC，Kim DW，Jung KY，et al.Increased expression of antioxidant enzymes in radioresistant variant from U251 human glioblastoma cell line［J］.Int J Mol Med，2004，13(6):883-887.

［7］ Dokic I，Hartmann C，Herold-Mende C，et al.Glutathione peroxidase 1 activity dictates the sensitivity of glioblastoma cells to oxidative stress［J］.Glia，2012，60(11):1785-1800.

［8］ Zhong W，Yan T，Lim R，et al.Expression of superoxide dismutases，catalase，and glutathione peroxidase in glioma cells［J］.Free Radic Biol Med，1999，27(11-12):1334-1345.

［9］ Zhao P，Zhao L，Zou P，et al.Genetic oxidative stress variants and glioma risk in a Chinese population:a hospital-based case-control study［J］.BMC Cancer，2012，12:617.

［10］ Schumacker PT.Reactive oxygen species in cancer cells:live by the sword，die by the sword［J］.Cancer Cell，2006，10(3):175-176.

［11］ Day BW，Stringer BW，Boyd AW.Eph receptors as therapeutic targets in glioblastoma［J］.Br J Cancer，2014，111(7):1255-1261.

［12］ 王秋林，王浩毅，王树人，等.氧化应激状态的评价［J］.中国病理生理杂志，2005，21(10):2069-2074.

［13］ Chaudhari N，Talwar P，Parimisetty A，et al.A molecular web:endoplasmic reticulum stress，inflammation，and oxidative stress［J］.Front Cell Neurosci，2014，8:213.

［14］ Szatrowski TP，Nathan CF.Production of large amounts of hydrogen peroxide by human tumor cells［J］.Cancer Res，1991，51(3):794-798.

［15］ 许锡镇，李志强.uPA/uPAR与胶质瘤侵袭性和促血管生成的关系［J］.中华神经医学杂志，2009，8(5):535-537.

［16］ 方 茅，杜 彬，钟雪云，等.EGCG通过下调COX-2和MMP-2表达抑制人脑胶质瘤细胞的迁移和侵袭［J］.中国病理生理杂志，2010，26(10):1890-1894.