张昭　杨学军　宋雄英等

[摘要] 目的 探讨椎间失稳环境下软骨终板蛋白多糖的变化。 方法 选取48只6月龄日本大耳白兔，体重（2.50±0.15）kg，均在相同环境条件下喂养，随机分为对照组和实验组，每组各24只；两组兔均进行椎间手术失稳。实验组在手术失稳2个月后用椎弓根螺丝钉和张力钢丝弹性内固定的方法进行L6/7的稳定性重建，对照组不进行稳定性重建。两组分别在内固定术后2、4、6个月取材对椎间盘软骨终板蛋白多糖进行检测，比较不同时间软骨终板蛋白多糖水平变化。 结果 ①组内比较，两组术后2、4、6个月蛋白多糖灰度及光密度值比较，差异均有统计学意义（P < 0.05）。对照组术后4个月蛋白多糖灰度低于同组术后2个月，光密度值高于术后2个月，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；对照组术后6个月蛋白多糖灰度低于同组术后4个月，光密度值高于术后4个月，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。实验组术后4个月蛋白多糖灰度高于同组术后2个月，光密度值低于术后2个月，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；实验组术后6个月蛋白多糖灰度高于同组术后4个月，光密度值低于术后4个月，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。②组间比较，实验组术后6个月蛋白多糖灰度高于对照组，光密度值低于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 弹性内固定能有效地阻止椎间盘软骨终板蛋白多糖的退变，而且有部分恢复的征象，它为进一步进行其他治疗创造了必要条件。

[关键词] 兔椎间盘；软骨终板；蛋白多糖；弹性内固定

[中图分类号] R681.53 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）08（c）-0004-05

[Abstract] Objective To investigate the change of cartilage endplate protein polysaccharide in the condition of intervertebral instability. Methods 48 white macrotia rabbits of 6 months old with （2.50±0.15） kg weight were fed in the same environment and randomly divided into the control group and the experiment group， with 24 rabbits in each group. Rabbits in the two groups were all given intervertebral instability surgery. Rabbits in experiment group were reconstructed the L6/7 stability with pedicle screw and tension wire elastic internal fixation 2 months after the intervertebral instability surgery. Rabbits in control group were not reconstructed the L6/7 stability. The intervertebral disc cartilage endplate protein polysaccharide were detected in the two groups 2， 4， 6 months after the internal fixationi； the cartilage endplate proteoglycan level among different time were compared. Results ①The differences of protein polysaccharide grayscale and optical density value in the two groups 2， 4， 6 months after the fixation operation by variance analysis were statistically significant （P < 0.05）. The protein polysaccharide grayscale 4 months after fixation operation in control group were lower than those 2 months after fixation operation in the same term， the optical density values 4 months after fixation operation in control group were higher than those 2 months after fixation operation in the same term， the differences were statistically significant （P < 0.01）； the protein polysaccharide grayscale 6 months after fixation operation in control group were lower than those 4 months after fixation operation in the same term， the optical density values 6 months after fixation operation in control group were higher than those 4 months after fixation operation in the same term， the differences were statistically significant （P < 0.01）. The protein polysaccharide grayscale 4 months after fixation operation in experiment group were higher than those 2 months after fixation operation in the same term， the optical density values 4 months after fixation operation in experiment group were lower than those 2 months after fixation operation in the same term， the differences were statistically significant （P < 0.01）； the protein polysaccharide grayscale 6 months after fixation operation in experiment group were higher than those 4 months after fixation operation in the same term， the optical density values 6 months after fixation operation in experiment group were lower than those 4 months after fixation operation in the same term， the differences were statistically significant （P < 0.01）. ②The protein polysaccharide grayscale 6 months after fixation operation in experiment group were higher than those in control group， the optical density values 6 months after fixation operation in experiment group was lower than those in the control group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The dynamic internal fixation can effectively prevent the degeneration of the proteoglycan cartilage endplate and partly recover from the degeneration. It can create the necessary condition for the other treatment.

[Key words] Rabbit intervertebral disc； Proteoglycan； Cartilage endplate； Dynamic internal fixation

椎间盘软骨终板的退变过程是受各种因素影响变化的，这些因素包括生物自身拥有的内部因素和生物体所处各种外部环境因素，因此每个生物体在不同环境、不同时间段软骨终板的退变过程是不同的[1-2]。首先，传统的椎间失稳椎体间的融合内固定后椎间软骨终板仍是退变的[3-4]，而且其软骨终板也没有修复或恢复；其次，传统的脊柱融合内固定术后会出现临近节段椎间盘退变加重的问题[5-7]，同时也有融合节段椎间活动功能丧失的问题；另外，关节失稳后的稳定性重建可有效阻止关节软骨的退变，而且术后关节疼痛等症状明显缓解。近年来，随椎间失稳后各种椎体间的弹性内固定术的开展，逐步认识到：椎间弹性内固定可有效治疗由椎间失稳引起的腰腿痛，也可有效缓解临近节段椎间盘的退变，并能适度保留椎体间的活动功能。本研究通过手术咬除兔L6椎体的两侧下关节突，单一改变腰椎内部结构造成椎间失稳，其后用张力钢丝弹性内固定的方法进行椎间稳定性重建，研究张力钢丝弹性内固定对软骨终板蛋白多糖退变的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

取48只6月龄日本大耳白兔[内蒙古农业大学动物实验中心提供，实验动物许可证号：SYXK（蒙）2004-0023]，雌雄不限，体重（2.50±0.15）kg，均在相同环境下喂养，随机分为对照组和实验组，每组各24只。

1.2 手术方法

将两组实验兔行手术椎间失稳造模，具体手术方法：将其腰背部皮毛刮除至清洁，用安定注射液（天津金耀药业有限公司，批号：0502043）1.25 mg/kg、氯胺酮（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号KH050305）0.02 g/kg、阿托品（天津金耀氨基酸有限公司，批号：0503151）0.125 mg/kg顺次耳缘静脉注射麻醉后，俯卧位固定于手术台上，用1%碘伏消毒手术区域；术者穿一次性无菌手术衣、戴无菌手套、铺无菌手术巾，取双侧平对髂脊椎间隙（即L6/7）为中心，从正中做一长约5 cm纵行切口，切开皮肤及皮下组织，分离暴露棘突、椎板及上下关节突，然后依次切除L6/7棘上及棘间韧带，咬除L6椎体下位全部小关节突，造成椎间失稳，用无菌生理盐水反复冲洗手术切口3次，依次缝合各层组织；术后各兔在单一笼中自由活动。2个月后将实验组24只兔用椎弓根螺丝钉及张力钢丝弹性内固定法进行L6/7的稳定性重建，术后兔仍在单一笼中自由活动；对照组不进行稳定性重建。

1.3 软骨终板蛋白多糖水平检测

两组兔均在实验组术后2、4、6个月取椎间盘软骨终板，采用过碘酸-Schiff（PAS）反应法检测其中蛋白多糖水平。

1.3.1 试剂 ①DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，编号：DAB-0031/1031）、APES防脱片剂（福州迈新生物技术开发有限公司，编号：GLU-0048）、UltrasensitiveTMSP超敏试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，编号：Kit-9710/9720/9730）；②偏重亚硫酸钠（上海试剂四厂，批号：700710）；③碱性品红（HG2-313-80）（天津市胜利化工厂，批号：060114）；④乙二胺四乙酸（EDTA）[汕头市金砂企业（集团）金砂化工厂，分析纯]；⑤Schiff液的配制：碱性品红5 g加入煮沸的蒸馏水100 mL，振荡5 min，冷却至50℃过滤，加入1 mol/L盐酸10 mL，冷却至25℃时加偏重亚硫酸钠3 g并遮光放置24 h后加入活性炭（吸色）1 g，振荡1 min后过滤，将滤液遮光保存在0～4℃处备用。

1.3.2 设备 ①徕卡RM系列C14662光镜样品切片机（德国）；②LKB-UltrotomeⅤ型超薄切片机（瑞典）；③JD801图像分析系统（江苏捷达科技有限公司）；④BG-9000 C形臂X线机，手提式X线透视仪BJI-1X型（德国）；⑤手术器械：指骨用螺钉100只（直径2 mm、长10 mm）、医用钢丝300 cm（直径0.9 mm）；⑥HR-7751-M型微波炉（山东青岛海尔公司）。

1.3.3 取材 将实验兔耳缘静脉注射25 mL空气栓塞处死，用骨刀快速切取完整L6/7椎间盘并保留部分软骨终板下松质骨，先取横截面为2 mm×2 mm左右包含软骨终板并包含部分软骨终板下松质骨的组织放入3%戊二醛固定液中固定，余组织放入中性甲醛溶液中固定，24 h后用15%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液脱钙[8-10]。

1.3.4 脱钙 将所取的软骨终板组织放入装有15%EDTA溶液的安瓿中，软骨终板组织用硫酸纸标记，安瓿用瓶盖封闭放入约盛1200 mL 17℃自来水的塑料盆中，在微波炉中用中低两档加热12 min，然后换1200 mL 17℃自来水继续在微波炉中用中低两档加热12 min，自来水用来控制软骨终板组织脱钙时的温度始终在50℃以下，如此每日反复2 h后换15%EDTA溶液，放入37℃温箱中过夜，第2天再换1次15% EDTA溶液进行微波脱钙，标本可用8 d左右完成脱钙，完整椎间盘可用16 d左右完成脱钙[11-12]。

1.3.5 制片 载玻片清洁后用3-氨丙基-3-甲氧基硅烷（APES）防脱片剂（丙酮50倍稀释）常规处理，盖玻片常规清洁处理；脱钙后将组织用自来水冲洗12 h→5%无水硫酸钠饱和溶液浸泡8 h→自来水冲洗12 h→（脱水）50%乙醇12 h→（脱水）70%乙醇12 h→（脱水）80%乙醇8 h→（脱水）95%乙醇（Ⅰ）3 h→（脱水）95%乙醇（Ⅱ）3 h→（脱水）100%乙醇（Ⅰ）2 h→（脱水）100%乙醇（Ⅱ）2 h→（透明）二甲苯15 min→（渗蜡）48～50℃软蜡10 min→（渗蜡）54～56℃软蜡30 min→（渗蜡）56～58℃软蜡50 min→石蜡包埋→修块→切片[13-15]。

1.3.6 软骨终板蛋白多糖的变化 蛋白多糖的检测采用PAS反应法。60℃烤片30 min→（脱蜡）二甲苯（Ⅰ）10 min→（脱蜡）二甲苯（Ⅱ）10 min→（脱苯）100%乙醇（Ⅰ）10 min→（脱苯）100%乙醇（Ⅱ）10 min→（水化）95%乙醇（Ⅰ）10 min→（水化）95%乙醇（Ⅱ）5 min→（水化）80%乙醇（Ⅰ）5 min→（水化）80%乙醇（Ⅱ）5 min→蒸馏水10 min→1%过碘酸液氧化10 min→自来水充分洗3 min蒸馏水过洗→加入Schiff液15 min（遮光）→自来水流水冲洗15 min，显色（红色）→苏木精复染5 min→自来水流水冲洗8 min→（分化）1%盐酸2 s→（返蓝）水冲洗25 min→（脱水）80%乙醇一涮→（脱水）95%乙醇（Ⅰ）10 min→（脱水）95%乙醇（Ⅱ）10 min→（脱水）100%乙醇（Ⅰ）10 min→（脱水）100%乙醇（Ⅱ）10 min→（二甲苯透明）二甲苯（Ⅰ）10 min→二甲苯（Ⅱ）10 min→封片[16-18]。采用JD801图像分析系统进行图像分析，比较灰度及光密度值，通过对照片的灰度进行分析来测量样品的光密度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；两组间比较采用t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

组内比较，对照组术后4个月蛋白多糖灰度低于同组术后2个月，光密度值高于术后2个月，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；对照组术后6个月蛋白多糖灰度低于同组术后4个月，光密度值高于术后4个月，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。实验组术后4个月蛋白多糖灰度高于同组术后2个月，光密度值低于术后2个月，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；术后6个月蛋白多糖灰度高于同组术后4个月，光密度值低于术后4个月，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。组间比较，实验组术后6个月蛋白多糖灰度高于对照组，光密度值低于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1、图1（封三）。

3 讨论

近年来，临床在处理椎间盘组织退变方面应用了许多分子生物学和基因技术[19-21]，但出现的问题仍然是经各种治疗后，患者仅在一段时间内或某些特定环境条件下有效，远期效果方面始终不能达到预期。颈肩痛、腰腿痛大都是由于脊柱长期的退变形成椎间失稳所导致[22-24]。因此，传统颈肩痛、腰腿痛均采用神经减压椎间盘摘除椎间融合术治疗，给患者带来脊柱活动受限及以后临近节段椎间盘退变加重等并发症。近期使用的脊柱弹性内固定系统（Bioflex、Dynesis K-ROD、Coflex等）已取得了一定的临床疗效，但也存在不足；为能从根本上解决目前各种治疗的短效问题，本研究采用张力钢丝弹性内固定重建椎间稳定的方法来阻止椎间失稳后软骨终板的退变。

本研究显示，张力钢丝弹性内固定椎间失稳后稳定性重建，在术后2、4、6个月短期内，实验组软骨终板蛋白多糖灰度逐渐升高，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；软骨终板蛋白多糖光密度逐渐下降，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；组间比较，实验组术后6个月蛋白多糖灰度高于对照组，光密度值低于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05），这与近期相关的研究数据相符[25-26]。由此推理手术张力钢丝弹性内固定进行失稳后椎间稳定性重建可使软骨终板蛋白多糖的含量明显增加[27]；这也说明张力钢丝弹性内固定术能有效阻止软骨终板的退变和部分恢复软骨终板结构，从而提示在椎间失稳的早期尽快恢复椎间盘的生物力学结构[28-30]，可为椎间盘的修复创造良好的环境，也为其他各项治疗提供良好的前提条件。为此可推理，在椎间失稳的状态下进行各种因子和各种基因技术的治疗都是效果欠佳的，因为在失稳状态下椎间盘内生物化学环境相对来说是恶劣的，因此植入的各种因子和基因载体所发挥的作用有限[31-33]。相关学者在各自的临床实践中得出相关结论显示，如因椎间失稳造成的颈肩痛及腰腿痛，在进行其他治疗前则首先考虑进行椎间的生物力学稳定性重建，使其更接近正常椎间结构的生物力学状态，以充分发挥其他治疗的效果[34-35]。至于手术弹性内固定治疗时效性有待于以后进一步的临床和动物的相关实验研究论证[36]。

综上所述，张力钢丝弹性内固定进行失稳后的椎间稳定性重建能有效阻止椎间软骨终板蛋白多糖的退变，并能使退变的软骨终板蛋白多糖得到部分的恢复。

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（收稿日期：2015-05-10 本文编辑：程 铭）