徐洋涛等

【摘要】目的研究诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）和血管内皮生长因子（VEGF） 在碱烧伤后兔角膜新生血管（CNV）形成中的作用及其机制。方法用氢氧化钠滤纸片烧伤兔角膜建立新生血管动物模型，根据不同处理因素将实验兔分为三个实验组和一个对照组，每组12只。三个实验组结膜下注射不同剂量的三氧化二砷；对照组结膜下注射0.9%氯化钠。在裂隙灯下查看碱烧伤后角膜大体情况，计算角膜新生血管的面积。分别在兔角膜碱烧伤后7天、14天、28天，行兔角膜组织HE染色及免疫组化法检测iNOS和VEGF。 结果各实验组角膜新生血管面积均小于对照组 （P<0.05或0.01）；实验组角膜比对照组更光滑透明；角膜iNOS和VEGF表达情况：各组碱烧伤后第7天开始增高，14天时达到峰值，随后逐渐降低，并且对照组的表达明显高于实验组。结论兔角膜碱烧伤后CNV形成与iNOS和VEGF密切相关；三氧化二砷对CNV形成具有一定抑制作用。

【关键词】一氧化氮合成酶；血管内皮生长因子；三氧化二砷；角膜新生血管

中图分类号：R774.1 文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2015.04.011

【Abstract】ObjectiveTo study effect and mechanism of inducible nitric oxide synthase （iNOS） and vascular endothelial growth factor（VEGF） in corneal neovascularization （CNV） after corneal alkali burn.MethodsAnimal models of neovascularization were established by burning rabbits corneas with sodium hydroxide filter papers.According to different kinds of treatments，experiment rabbits were divided into three experimental groups and one control group，with 12 rabbits in each group.The three experimental groups were given different doses of As2O3 by subconjunctival injection，while the control group were treated with 0.9% sodium chloride by subconjunctival injection.Corneas after alkali burn were observed under slit lamp，and areas of CNV were calculated.Rabbit corneal tissue HE staining and immunohistochemistry method were used to measure iNOS and VEGF 7，14 and 18 days after corneal alkali burn，respectively.Results Areas of CNV of all experimental groups were smaller than that of the control group（P<0.05 or 0.01），and the corneas of the experimental groups were more smooth and transparent than that of the control group.Expressions of iNOS and VEGF in corneas of all groups began to increase on the 7th day and reached the peak on the 14th day after alkali burn，then decreased gradually.And the expressions of the control group were significantly higher than those of the experimental groups.ConclusionCNV formation after corneal alkali burn is closely related with iNOS and VEGF.Besides，As2O3 has some inhibitory effect on CNV formation.

【Key words】iNOS；VEGF；As2O3；CNV

生理状态下角膜透明无血管，处于免疫赦免区之中，这是保持角膜正常生理功能的先决条件。在某些病理状态如炎症、碱烧伤、移植等时，会出现角膜新生血管。有研究表明，诱导型一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）在眼内含量丰富，角膜上皮和内皮均含有iNOS，其促进生成一氧化氮（NO），NO则能促进新生血管的形成[1]，此外iNOS对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）具有一定调控作用[2～3]，VEGF是新生血管发生发展过程中重要的影响因子，因此在角膜新生血管形成机制的研究中该因子成为研究热点。目前，对于角膜新生血管的治疗非常棘手，至今还没有特效药物以及特效的治疗方法。近年来研究发现，作为抗肿瘤药物的三氧化二砷具有抑制新生血管的作用[4]。本研究应用氢氧化钠滤纸片烧伤兔角膜建立新生血管动物模型，结膜下注射三氧化二砷溶液，观察兔角膜碱烧伤后角膜新生血管生成的情况，免疫组化染色检测iNOS、VEGF在角膜新生血管形成过程中的表达，探讨角膜新生血管的发生机制。

1材料与方法1.1材料实验应用试剂：兔抗iNOS单克隆抗体，兔抗VEGF单克隆抗体，DAB显色试剂盒（购于武汉博士德生物公司）；二步法免疫组化试剂盒（购于北京中山生物技术有限公司）；As2O3（哈尔滨医科大学第一临床医学院医院提供）。实验动物：大白兔（哈尔滨医科大学第一临床医学院提供）。48只实验兔随机分为0.1 ml组、0.3 ml组和0.5 ml组三个实验组和一个对照组，每组12只，实验组结膜下分别注射1 g/L的三氧化二砷0.1 ml，0.3 ml，0.5 ml，对照组0.3 ml生理盐水结膜下注射；每周两次。

1.2动物模型制备结膜囊滴倍诺喜表面麻醉，氯胺酮（25 mg每千克体重）肌肉注射麻醉；7 mm直径滤纸片浸入1 mol/L的氢氧化钠溶液中30秒，取出置于兔角膜中央2分钟后拿开滤纸，用生理盐水冲洗；适量红霉素眼膏及阿托品眼膏涂于结膜囊内。碱烧伤后每日在裂隙灯下观察兔角膜，每次测量角膜新生血管的长度和数量，并记录。应用Robert电脑数学模型公式：A=C/12×3.1416[r2（rL）2]（A代表新生血管面积，C为CNV累及角膜的圆周钟点数，L为CNV长入角膜的长度，r代表角膜半径）计算角膜碱烧伤后6天、12天、15天、21天及28天CNV面积，并分别于碱烧伤后7天、14天、28天拍摄兔角膜外观图像（见图1）。

1.3HE染色及免疫组化染色烧伤后第7天、14天、28天各组随机空气栓塞处死4只兔，取角膜组织，4%多聚甲醛固定液中固定、石蜡包埋切片，行HE染色（见图2）。免疫组化染色应用PowerVisionTM二步法，一抗为兔抗iNOS、兔抗VEGF，二抗为羊抗兔抗体。

2.2免疫组化检测iNOS及VEGF表达情况在碱烧伤后第7天，角巩膜缘前部基质新生血管管壁内皮细胞及炎性细胞胞浆可见iNOS和VEGF表达；对照组较实验组表达多（见图3、 图4）。碱烧伤后第14天，对照组表达iNOS及VEGF的炎性细胞及新生血管内皮细胞异常增多，三个实验组iNOS及VEGF表达与三氧化二砷用量成反比。碱烧伤后第28天，各组iNOS及VEGF表达均减少，且iNOS及VEGF表达情况基本一致。整体来看，在角膜碱烧伤后第7天时iNOS及VEGF表达较为显著，14天时表达达到一个明显高峰，之后表达开始降低。三个实验组的表达均低于对照组，结膜下应用三氧化二砷剂量与新生血管面积成反比。

3讨论角膜碱烧伤修复过程中，在炎症及缺氧状态下，新生血管自角膜缘向角膜中央生长。在此过程中多种细胞因子参与新生血管的生长调控。目前，研究发现VEGF是最强的促血管生成因子，它作用于血管内皮细胞，促进其分裂、增生、迁移并增强血管通透性[5]。一氧化氮（NO）是血管新生细胞内信号传递系统中重要的调节因子，短期暴露于VEGF下所产生的NO是激活酪氨酸激酶及三磷酸肌醇激酶后介导产生的，长期暴露于VEGF下所产生的NO是通过增加一氧化氮合成酶的表达实现的。一氧化氮合成酶是合成一氧化氮的限速酶，催化L精氨酸生成NO。研究发现NO能够诱导VEGF的表达并且调节VEGF的促新生血管的功能[6]。NOS主要分布在血管平滑肌细胞、血管内皮细胞以及各种炎症细胞的胞质内[7]。目前已确定三种不同类型的NOS，即诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）、神经核结构型一氧化氮合成酶（nNOS）及内皮结构型一氧化氮合成酶（eNOS）。eNOS仅能产生少量的NO，在完成神经系统的生理功能起着一定作用，例如它能调节平滑肌细胞的增生[8]。而iNOS是NO合成的关键酶，在炎症、外伤等刺激下，iNOS mRNA翻译产生促进CNV生成的NO[9]。而NO则是血管生成过程中重要的参与因素[10]。因此，在炎症、缺氧等因素下iNOS促进NO的生成，进而NO加强VEGF的促新生血管的作用。此外，有研究发现iNOS及VEGF是肿瘤生长过程中重要的参与因子，iNOS存在水平与VEGF相平行，促进NO合成以及调节VEGF水平是iNOS促新生血管形成的主要途径[11～13]。

本实验通过建立兔角膜碱烧伤模型，观察三氧化二砷对角膜新生血管形成过程的影响及探讨角膜新生血管形成机制。此次研究观察到角膜碱烧伤后免疫组化iNOS和VEGF表达明显增强，并具有一致的变化趋势，其主要分布在角膜前基质内炎性细胞以及新生血管内皮细胞；结膜下应用三氧化二砷后角膜新生血管面积明显少于对照组。因此我们认为，角膜新生血管的形成过程中，iNOS和VEGF是参与其中的重要细胞因子，并且三氧化二砷具有抑制角膜新生血管的作用。参考文献[1] Kon K，Fujii S，Kosaka H，et al. T.Nitric oxide synthase inhibition by N（G）nitroLarginine methyl ester retards vascular sprouting in angiogenesis[J].Microvasc Res，2003，65（1）：28.

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