徐 翔， 汪海滨， 孙中生， 周绍龙， 曾 立， 罗盛康

脂肪移植与研究

脂肪来源SVF联合PRP注射改善鼻唇沟的临床研究

徐 翔， 汪海滨， 孙中生， 周绍龙， 曾 立， 罗盛康

目的 观察并分析富含血小板血浆(PRP)联合血管基质片段(SVF)治疗面部鼻唇沟的有效性及安全性。 方法 对30 例鼻唇沟明显的患者，从外周静脉获取血液，通过离心法获得PRP；在患者大腿外侧抽取脂肪，并通过酶解法获取脂肪组织的SVF。按一定比例混合后，注射在鼻唇沟的真皮深层及皮下组织层。治疗医师依据皱纹评估分级(WAS)，对鼻唇沟进行评估，评估时间点为术前,术后即刻、7 d、1个月、3个月、6个月。结果 所有患者的鼻唇沟都得到了较大程度的改善，注射过程中及术后未出现动静脉栓塞、注射区皮肤及组织坏死、感染、纤维化、组织变硬及形成肿块等并发症。术前WAS评分为3.30 ± 0.47，术后即刻、7 d、1个月、3个月、6个月分别为1.22±0.54、0.69±0.45、0.98±0.55、1.18±0.64、1.23±0.72。其中，术后7 d的WAS评分下降程度最低，术后观察点WAS评分与术前相比，差异均具有统计学意义(P<0.001)。 结论PRP联合SVF疗法，在不采用外源性填充材料的情况下，可以显著改善中老年患者的鼻唇沟凹陷，有非常好的应用前景。

血管基质片段； 富血小板血浆； 鼻唇沟； 面部年轻化

自体脂肪移植由于取材丰富、操作简单等优点，成为自身软组织缺损填充的研究热点。有文献证实，血管基质片段(stromal vascular faction， SVF)中富含的脂肪间充质干细胞在脂肪移植后的恢复过程中发挥着更为重要的作用[1-2]。此外，还有大量文献证实，从人体血液中获取的富血小板血浆(platelet rich plasma， PRP)，通过注射法植入体内后,可以大量释放细胞因子，如：PDGF、VEGF、TGF等，能够刺激成纤维细胞的增殖及胶原成分的沉积[3-5]。因此，自2013年3月至2014年6月，我们基于细胞疗法与细胞因子疗法相结合对改善组织容量的考虑，将PRP与SVF混合后,注射于鼻唇沟真皮深层及皮下组织层，临床效果满意。现报道如下。

1 临床资料

本组共30例患者。男性8例，女性22例；年龄30～57岁，平均44岁。均为WAS评分[6]为3.0～4.0分的中、重度鼻唇沟患者，近6个月内未进行任何鼻唇沟部位的处理和治疗。局部无皮损或其他皮肤疾病；肝肾功能正常；无严重过敏反应病史和出血性疾病史。女性患者未处于妊娠或哺乳期。

2 方法

2.1 PRP的制备 用21 G蝶形采血针经外周静脉获取血液9.0 ml，与1.5 ml抗凝枸橼酸盐溶液混合。采集血液在室温下经160 g离心10 min，离心后的血液分为3层，最上层为淡黄色血浆，最下层为红细胞层，血小板主要聚集在上下两层的交界区,即中间层。将上清液和中间层转移到另一试管内进行第2次离心，室温下400 g离心10 min。离心完成后，上层不含血小板血浆，下层即PRP(血小板浓度>1×106/μl)。在整个操作过程中，血小板未被激活。

2.2 SVF的制备 采用肿胀抽脂技术，于大腿外侧获取10 ml纯化脂肪，采用0.25%Ⅰ型胶原酶等量混合后，37 ℃消化30 min，期间每隔10 min进行震荡混匀处理，以使胶原酶和脂肪组织能够充分接触。消化完成后，采用200目过滤网过滤，过滤后，混悬液经1200 g离心5 min，倒弃离心管上层液体，紧贴管壁下端液体,即为SVF细胞群。

2.3 注射方法 将获得的2 ml PRP与SVF细胞群沉淀混合，分别用2支1 ml注射器进行分装。用1%利多卡因行双侧眶下神经阻滞麻醉，采用27 G针头按照线性注射方法，分别注入鼻唇沟真皮深层及皮下组织，针头与皮肤表面成20°～30°。由鼻唇沟下方至上方，深层至浅层，呈厥叶状注射(图1)，直至鼻唇沟完全矫正，注射完成后给予局部冰敷20 min。注射过程无需矫枉过正，每侧注射量均小于1 ml。

2.4 疗效评价 治疗医师分别在术前，术后即刻、7 d、1个月、3个月、6个月，依据WAS 对鼻唇沟进行评估。

3 结果

本组共30例患者每侧注射量为0.5～1.0ml,平均0.8ml。术后随访 6～9个月。注射完成后，鼻唇沟皱纹几乎完全矫正，术后6个月效果仍然维持(图2)；注射过程中未出现明显的出血或血管栓塞等并发症，1周内治疗区域轻微淤青完全消失，术后随访时未发现明显的结节和其他不良反应；术前WAS评分为3.30±0.47，术后即刻、7d、1个月、3个月、6个月分别为1.22±0.54、0.69±0.45、0.98±0.55、1.18±0.64、1.23±0.72。其中,术后7dWAS评分下降程度最低，术后观察点WAS评分与术前相比,差异均具有统计学意义(P<0.001)。

4 讨论

面部皮肤皱纹根据其分布位置可以分为额纹、眉间纹、鱼尾纹、法令纹及木偶纹等。根据其发生机制可以分为动态性皱纹及静态性皱纹。动态性皱纹的形成,主要是由于面部表情肌的过度活动而在皮肤表面留下痕迹[7]，针对这类皱纹的处理，临床上主要采用肉毒毒素进行局部注射治疗[8-9]。肉毒毒素是通过抑制神经末梢内部乙酰胆碱的释放而达到废用性肌肉萎缩，从而改善面部皱纹。静态性皱纹的产生机制主要有以下3种[10]：⑴由于动态性皱纹的长期存在，引起胶原纤维的断裂，从而导致皮肤表皮层及真皮层形成折痕；⑵随着年龄的增长，组织容量不断丢失，局部组织容量的不足使得皱纹更为明显[11]； ⑶由于长期的重力作用，使面部软组织整体下移。

图1 鼻唇沟注射填充方法示意

Fig 1 Methods of injecting filling of nasolabial fold.

图2 脂肪来源SVF联合PRP注射改善鼻唇沟前后对比 a.术前 b.术后即刻 c.术后6个月

Fig 2 Comparison between preview and postview of nasolabial fold augmentation using a combined injection of platelet rich plasma and adipose-derived stromal vascular fraction. a.preview. b. postview at once. c.postview at 6 months.

中老年人群的鼻唇沟通常是由于局部组织容量的不足而导致面部外观整体老态化。其治疗以注射填充恢复容量为主，主要治疗方法为注射可吸收真皮组织填充物。然而，所伴随的缺点包括改善效果短暂、填充物的再吸收；另外，如果注射永久性填充材料，还伴有异体反应，如包膜、肉芽肿形成，慢性或迟发型感染[12-13]。此外， 还有一些软组织填充材料依赖于自身组织的纤维化反应，达到容量扩增的效果，这部分材料也主要是人工合成的非生物材料。相比较而言,由自身所获得的软组织填充物则是一个较为合适的选择。

Azzena等[14]报道曾应用自体脂肪结合PRP的方法治疗凹陷性瘢痕；O′Connell等[15]还报道了65%的下肢静脉溃疡用PRP治疗后，在16周内可完全愈合。通过适当的方法进行低速离心产生富含血小板的血浆，富集后血浆中血小板浓度是全血中血小板浓度的60倍。这些血小板被证实其具有较高的生物活性，并且能在体外7 d内持续释放PDGF-BB、VEGF-A、TGF-b和IGF-1，这些细胞因子可以促进内皮细胞等的增殖。因此，我们认为，在真皮内或者真皮下层注射高浓度的血小板及生长因子，可以产生更多的自体胶原，从而增加局部组织容量。

Kakudo等[16]将脂肪来源干细胞及真皮成纤维细胞与PRP或不含血小板血浆(platelet-poor plasma, PPP)混合,结果发现，与PRP相混合的脂肪来源干细胞比与PPP相混合的干细胞，其增殖活性明显增加；而人真皮成纤维细胞的增殖活性也明显增强；同时还发现，当与5%的PRP混合后，人真皮成纤维细胞和脂肪来源干细胞在第7天的增殖活性达到最高。当与更高或者更低浓度的PRP相混合时，效果则不明显。 Choi等[17]发现，牙槽骨细胞在低浓度的PRP作用下增殖，但是在高浓度的PRP环境中，其增殖受到抑制。由此可知，为了达到最好的效果，生长因子的最佳浓度也是非常重要的，并不是我们传统所认为的越高越好。

血小板内的α颗粒包含许多细胞生长因子，这些生长因子在凝血酶或钙离子的作用下，可被激活[18]。激活后，短时间内将释放大量的生长因子，但这一过程是非持续性的。一些早期研究证实了与这一过程相关的组织学和临床效应，然而，这些效应只发生在早期并且是短暂的。因此，这一过程的缺陷是缺乏更为持续的作用效果。有趣的是，Scherer等[19]发现，与凝血酶激活后的血小板相比较，未激活的血小板在促进创面愈合方面更具优势，因而倾向于将未激活的血小板用于细胞疗法，而不是单纯的存储细胞因子。他们认为，在未激活的状态下，血小板能够保持良好的功能活性，并持续缓慢的释放细胞因子。因此，本研究中所使用的PRP提取物中，未添加氯化钙或者凝血酶等血小板激活物。

在PRP辅助创面愈合或者组织容量的补充过程中，在具备细胞因子的情况下，还需要其他细胞成分的参与，尤其是具备分化潜能的间充质干细胞的参与，这些细胞成分能在相关细胞因子的作用下进行增殖、分化。对这部分细胞成分进行适当的补充，能够更好地促进我们的治疗效果。SVF作为脂肪组织来源的混杂细胞群，包含富含CD34的间充质干细胞，具备来源丰富，获取简单等优点[20]。因此，选择SVF细胞群辅助鼻唇沟的软组织扩增，是十分有意义的。同时，本研究也是首次将PRP和SVF联合治疗鼻唇沟。

PRP联合SVF疗法的优势在于，在含有高浓度且可释放细胞因子的血小板的同时，又含有高浓度具备分化潜能的间充质干细胞。相关研究证实，在真皮或真皮下注射生长因子时，可刺激成纤维细胞的胶原沉积。本研究结果显示，术后7 d鼻唇沟的改善效果最佳，这可能与局部肿胀有关；7 d后改善效果开始减退；在术后1～6个月期间维持稳定，但效果还是明显优于治疗前。7 d后的表现可能是由于注射混合物的血清成分开始被吸收以及肿胀情况好转所致。在后期细胞因子的作用下，间充质干细胞能够分化为成纤维细胞，并分泌Ⅱ型胶原，从而维持鼻唇沟区域一定的组织容量。但是,其具体机制并不清楚，这是未来研究所要解决的问题。本组患者在最长9个月随访时间内，未发现鼻唇沟的再次复发；此外，在注射及随访过程中，未出现任何的不良反应和并发症，其治疗的安全性也是可靠的。更为详细、全面的治疗结果需要在扩大样本量的基础上进行观察和讨论。

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Improvementofnasolabialfoldbycombinedinjectionofplateletrichplasmaandadipose-derivedstromalvascularfraction

XUXiang,WANGHai-bin,SUNZhong-sheng,etal.

(DepartmentofPlasticSurgery,GuangdongSecondProvincialPeople′sHospital,Guangzhou510317,China)

Objective To observe the safety and efficacy of platelet rich plasma (PRP) and stromal vascular fraction (SVF) combined injection in correcting nasolabial folds. Methods Thirty female subjects with significant nasolabial folds were enrolled. Peripheral venous blood was obtained from each subject and was centrifuged to produce platelet rich plasma (PRP). Autologous fat was harvested from the lateral thighs of each subject to prepare the stromal vascular fraction (SVF) using enzymatic digestion. PRP and SVF were mixed proportionally, and the mixture was injected into the deep dermis and subcutaneous tissue of the nasolabial fold. The severities of nasolabial folds were evaluated by the treating surgeon using the wrinkles assessment scale (WAS) before the treatment, immediately after the treatment, at 7 days, 1 month, 3 months, and 6 months after the treatment. Results All subjects had significant nasolabial folds improvements. There were few complications, including vascular thrombosis, injection site skin or tissue necrosis, infection, fibrosis, tissue hardening or lumps, observed during and after the injection. Mean WAS scores immediately the treatment, at 1 week, 1 month, 3 months, and 6 months after treatment were 1.22±0.54, 0.69±0.45, 0.98±0.55, 1.18±0.64, 1.23±0.72 respectively, which were significantly lower than the score before the treatment (P<0.001). Conclusion The combined injection of PRP and SVF, without using any exogenous filler, can significantly improve the nasolabial depression of middle to elderly age patients. This technique may have good clinical applications in the future.

Stromal vascular fraction； Platelet rich plasma； Nasolabial fold； Facial rejuvenation

广东省医学科研基金资助项目(A2013130) 作者单位：510317 广东 广州，广东省第二人民医院 整形科 第一作者：徐 翔(1974-)，男，江西人，主治医师. 通信作者：罗盛康，510317，广东省第二人民医院 整形科，电子信箱：luoshengkang63@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2015.02.003

R

A

1673-7040(2015)02-0072-04

2014-11-04)