宋丹妮 王春台 刘学群 谭艳平 刘新琼 程钢

摘要：依据鉴定得到的水稻（Oryza sativa L.）核糖体蛋白质OsRPL2的序列设计了引物，从水稻叶片的cDNA中扩增得到目的片段。并对目的基因序列进行了测序鉴定和序列分析，同时在大肠杆菌中构建水稻核糖体蛋白质基因OsRPL2的原核表达载体pGEX-4T1-RPL2，转化入BL21（DE3）后利用IPTG诱导外源蛋白质表达并检测。结果表明，成功扩增出了水稻核糖体蛋白质基因OsRPL2的cDNA序列，大小为1 570 bp，其编码的蛋白质含有502个氨基酸。根据序列分析的结果，水稻OsRPL2基因与多个植物核糖体蛋白质L2基因具有较高的相似性，并且其编码的OsRPL2蛋白质具有2个与核糖体蛋白质功能相关的功能域。在此基础上，构建了具有pGEX-4T1-RPL2重组子，诱导表达后，纯化得到了带有GST标签的可溶性OsRPL2蛋白质。

关键词：水稻（Oryza sativa L.）；核糖体蛋白质基因；原核表达

中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2773-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.056

Cloning and Sequence Analysis， Expression Vector Construction of a Ribosomal Protein Gene OsRPL2 from Rice

SONG Dan-ni， WANG Chun-tai， LIU Xue-qun， TAN Yan-ping， LIU Xin-qiong， CHENG Gang

（South-Central University for Nationalities/Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of

Special Plants in Wuling Area of China， Wuhan 430074，China）

Abstract： On the basis of identified rice ribosomal protein sequences，a primer was designed to amplify OsRPL2 gene from rice（Oryza sativa L.） leaves cDNA. The obtained sequence was sequenced and analyzed， meanwhile，inserted into plasmidp GEX-4T1 to generate a prokaryotic expression vector pGEX-4T1-RPL2 which was transferred into the Escherichia coli BL21 （DE3） strain， and then the protein expression was detected after induced by IPTG. The results showed that， the amplified fragment was identical to the cDNA sequence of OsRPL2 and contained a complete open reading frame of 1 570 bp， encoding a protein of 502 amino acid residues. Meanwhile，OsRPL2 gene has a high similarity with several plant ribosomal L2 genes，and the encoded OsRPL2 protein has two domains associated with ribosomal protein function. In addition， the soluble OsRPL2 protein with GST label was purified after IPTG inducing.

Key words： rice（Oryza sativa L.）； ribosomal protein gene； prokaryotic expression

核糖体蛋白质是真核生物和原核生物细胞中一种丰富的蛋白质，广泛存在于高等植物的细胞质、叶绿体和线粒体中，是生物细胞内重要的细胞器，其蛋白质占细胞蛋白质的15%，在蛋白质的生物合成中起重要作用。真核生物的核糖体为80S，由40S和60S两个亚基构成，包含3～4种RNA分子和80多种不同的蛋白质[1]。近年的研究发现，核糖体蛋白质具有核糖体外功能，参与复制、转录、翻译调控，正常细胞恶性转化，细胞的凋亡调控，细胞的分裂、增殖、分化以及DNA修复等[2，3]，因此近年来核糖体蛋白质的功能也受到越来越多的关注。

目前在真核生物中发现的核糖体蛋白质有80余种，核糖体蛋白质包括S1-S33，L1-L44，它们与核内的rRNA结合分别构成40S、60S大小亚单位[4]，有关核糖体和核糖体蛋白质的研究主要集中在昆虫、哺乳动物、真菌和细菌，植物方面尤其是水稻中的表达情况研究的不多[5，6]。研究发现一些已知的核糖体蛋白质有类似的功能，如黑麦的核糖体蛋白质基因ScRPS7能抵抗低温胁迫[7]，Kim等[8]发现小豆中的3个核糖体蛋白质GmRPS13、GmRPS6、GmRPL37在转录或核糖体组装过程中起到重要作用，并证明了其编码基因可以提高小豆耐低温的能力；杜志如等[9]发现水稻（Oryza sativa L.）OsRPL14基因在低温和干旱时的表达量增加。水稻核糖体蛋白质OsRPL2的功能目前未见报道。武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室从构建的水稻粤泰A品种cDNA文库中鉴定得到了水稻核糖体OsRPL2基因，因此本研究将水稻OsRPL2基因进行克隆并进行序列分析及蛋白质表达载体构建，为深入研究OsRPL2基因的生物学功能提供基础和线索。

1 材料与方法

1.1 材料

选取pGEX-4T1原核表达载体，大肠杆菌菌株BL21（DE3）和DH5α由中南民族大学国家民委生物技术重点实验室提供。

1.2 主要试剂及工具酶

凝胶回收试剂盒、凝胶清洁试剂盒与反转录试剂盒均购自Axygen公司；Pageruler？誖Prestained 预染蛋白质分子质量Marker购自Frementas公司；限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ、T4 DNA连接酶、rTaq酶、DNA分子质量Marker均购自Takara公司。

1.3 水稻RNA的提取

分别称取100 mg水稻粤泰A的叶片，放入已经处理好的研钵中，加入液氮研磨至完全粉末状，加1 mL Trizol，继续研磨，直到均一相液体，转至无RNase的1.5 mL 离心管中。4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清液至新管中后室温放置5 min。加入0.2 mL氯仿，振荡混匀15 s后室温放置3 min，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min。取最上层水相转移至新管，体积大约为起始加入Trizol体积的60%。往水相里加入0.25 mL异丙醇及0.25 mL浓盐沉淀液（0.8 mol/L柠檬酸钠和1.2 mol/L NaCl）以沉淀RNA。混匀后室温放置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min， RNA沉淀于管底。加入1 mL 75%乙醇， 温和振荡离心管， 悬浮沉淀。 4 ℃ 8 000 r/min离心5 min，尽量弃上清。超净台上室温干燥20 min左右，用20 μL RNase-free H2O溶解RNA，振荡30 s，稍离心。使用变性胶进行电泳， 以防止RNA的降解。然后用反转录试剂盒反转得到cDNA。

反转录反应体系： RNase Free H2O 1 μL，5× RT buffer 4 μL，Random Primer （25 pmol/μL） 1 μL， RNase Inhibitor （10 U/μL） 1 μL，dNTP Mixture（各10 mmol/L） 2 μL， RNA 10 μL，ReverTra Ace 1 μL。反应程序：30 ℃ 10 min， 42 ℃， 20 min， 99 ℃ 5 min， 4 ℃ 5 min。

1.4 OsRPL2基因的扩增

根据水稻OsRPL2蛋白质在NCBI的nr蛋白质数据库中的蛋白质序列（序列号：YP_002000581设计出RPL2-CDS的引物，引物序列RPL2-F：5′-ATGAGACAAAGCATAAAGGG-3′；RPL2-R：5′-AATTCTGCGTTTCCCCAC-3′。

采用10 μL体系进行PCR反应，反应体系为：10×PCR缓冲液1.0 μL，RPL2-F（10 μmol/L） 0.2 μL，RPL2-R（10 μmol/L） 0.2 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L） 0.8 μL，模板cDNA 1.0 μL，rTaq酶（5 U/μL） 0.1 μL，H2O 6.7 μL。PCR反应程序：94 ℃ 预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，34个循环；72 ℃延伸10 min。扩增反应完成后进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 序列分析

使用NCBI 网站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）序列比对软件blastn、blastp程序及功能域分析软件Conserved Domain Search Service （CD Search）程序和瑞士生物学信息研究所网站ExPASy的Protscale程序（http：//expasy.org/tools/protscale.html）进行蛋白质疏水性分析。

1.6 原核表达载体的构建

设计RPL2-CDS的引物，引入BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，利用PCR反应扩增出目的片段，PCR引物序列：RPL2-CDS-F： 5′-CGCGGATCCATGAGACAAAGCATAAAGGG-3′；RPL2-CDS-R：5′-CCGCTCGAGAATTCTGCGTTTCCCCAC-3′。

反应体系、程序及检测同“1.4”。

用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ同时双酶切目的片段和pGEX-4T1空载体，37 ℃酶切过夜，使用凝胶回收试剂盒对酶切产物进行切胶回收和清洁回收目的片段及载体片段。16 ℃用T4 DNA连接酶连接RPL2-CDs的目的片段和pGEX-4T1载体片段7 h后转化DH5α感受态细胞，涂Amp+平板后于37 ℃恒温培养箱过夜培养。从平板上随机挑取单克隆，提取质粒并且进行PCR及双酶切鉴定，鉴定结果为阳性的单克隆送去测序。

1.7 重组蛋白质的原核表达

1.7.1 重组蛋白质的诱导 用重组质粒pGEX-4T1-RPL2转化BL21菌株，涂Amp+平板后于37 ℃恒温培养箱过夜培养，挑取阳性克隆单菌落，接种于5 mL含Amp+的LB液体培养基中，于37 ℃摇床中180 r/min振荡培养过夜。按1∶1 000的接种量进行接种，吸取约250 μL菌液接种于250 mL含Amp+的LB液体培养基中，37 ℃摇床中180 r/min振荡培养至OD600≈0.6。加入0.7 mol/L IPTG至终浓度为0.7 mmol/L。于17 ℃和37 ℃振荡培养8 h诱导蛋白质的表达。同时，诱导不加IPTG的pGEX-4T1-RPL2和pGEX-4T1空载体的BL21菌株作为阴性对照。

1.7.2 重组蛋白质的SDS-PAGE检测 将诱导表达完成的菌液转入离心管中，4 000 r/min离心10 min，倒尽上清液，收集菌体，加入3 mL预冷 PBS（pH 7.4）缓冲液，缓慢用枪头吹打菌体使菌体重新悬浮，在冰浴中进行超声波破碎细胞，破碎10 s，间隔10 s，每管破碎15 min，此时收集蛋白质混合液。在4 ℃、4 000 r/min离心15 min，分别收集蛋白质上清和沉淀。在各个取样中分别加入蛋白质上样缓冲液并混合均匀，沸水中煮15 min，进行10 % SDS-PAGE检测。恒压100 V电泳，当溴酚蓝指示剂电泳至胶底部边缘或略微冒出时即可停止电泳（大约2.5 h）。用考马斯亮蓝染色液染色3 h后用脱色液进行脱色。

1.7.3 重组蛋白质表达的Western blot检测 将诱导表达的蛋白质用10% SDS-PAGE胶电泳至溴酚蓝指示剂电泳至胶底部边缘，电转仪横流80 mA 转膜3 h，使蛋白质条带转移到醋酸纤维素薄膜上，先用40 mL封闭液室温静置封闭1 h，按1∶15 000的比例在封闭液中加入GST一抗，在4 ℃环境下振荡封闭过夜，按1∶10 000的比例加入二抗羊抗兔至封闭液中，放入孵育箱内28 ℃振荡孵育封闭1 h后进行化学发光信号检测。

2 结果与分析

2.1 水稻总RNA的提取和OsRPL2基因的克隆

用Trizol从水稻粤泰A的叶片中提取RNA，琼脂糖凝胶结果显示提取的RNA效果良好（图1）。根据检测的RNA浓度利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，保存在-20 ℃备用。

利用设计好的OsRPL2基因CDS上下游引物通过PCR程序从水稻cDNA中扩增目的条带，1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的PCR产物，结果（图2）表明获得了与预期片段大小相符的清晰的目的条带。将该片段进行TA克隆及测序，测序结果表明克隆得到的水稻OsRPL2基因与GenBank中序列一致，说明获得的OsRPL2基因是正确的。

2.2 水稻OsRPL2基因及蛋白质的序列分析

根据克隆得到水稻核糖体蛋白质基因OsRPL2的cDNA序列，分析得到OsRPL2基因的cDNA全长为1 570 bp，其编码的蛋白质含有502个氨基酸，蛋白质大小为54.9 ku（图3）。

将OsRPL2基因序列与不同植物来源的编码核糖体蛋白质L2的基因进行了同源性比较，发现它与同属禾本科的粟米核糖体蛋白质L2基因的同源性最高，基因序列的相似性达到了95%，而与芭蕉科的野芭蕉核糖体蛋白质L2基因及茄科的番茄核糖体蛋白质L2基因的相似性都达到87%。但水稻OsRPL2基因序列与非植物类别的真核生物核糖体蛋白质L2基因不具有明显的相似性，说明水稻OsRPL2基因是一种进化上较为保守的基因。

对水稻OsRPL2蛋白质序列使用蛋白质功能域分析软件CD Search进行分析，发现OsRPL2蛋白质具有2个明确的功能域（图4），分别是第22～80个氨基酸的RNA binding功能域和第359～486个氨基酸的C-terminal domain功能域。同时为了获得可溶性的外源表达OsRPL2蛋白质，使用瑞士生物学信息研究所提供的Protscale程序进行蛋白质疏水性分析，结果表明水稻OsRPL2蛋白质是部分可溶性蛋白质，该蛋白质理论等电点pI为10.87。这些为进一步获得外源表达的可溶性OsRPL2蛋白质提供了帮助和借鉴。

2.3 水稻OsRPL2基因原核表达载体的构建

将水稻OsRPL2基因通过BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点克隆到原核表达载体pGEX-4T1上，通过PCR鉴定，目的片段大小为1 570 bp；另外，通过双酶切鉴定显示，构建完成的载体经过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，得到大小分别为5 000 bp和1 570 bp的条带，与预期估计条带大小相同。将构建好的载体送生物公司测序，其测序结果100%匹配，成功构建了带有GST标签的阳性重组表达质粒（图5）。

2.4 重组蛋白质表达的SDS-PAGE检测结果

将阳性重组质粒点击转化入BL21表达菌株，经过IPTG诱导后，将诱导表达的pGEX-4T1-RPL2细菌菌体收集后用遇冷的PBS重悬，在冰浴中进行超声波破碎。用10% SDS-PAGE检测表达产物，经过考马斯亮蓝染色，17 ℃和37 ℃均可观察到在70～100 ku间诱导处理后的样品与pGEX-4T1空载和未经诱导的pGEX-4T1-RPL2蛋白质样品存在明显的特异蛋白质，其大小与预测的OsRPL2蛋白质产物大小相同，且在混合液和上清中均有目的蛋白质（图6），表明OsRPL2基因在pGEX-4T1系统中得到了高效表达，其表达产物为部分可溶性蛋白质。

2.5 重组蛋白质表达的Western blot检测结果

用GST单抗对诱导表达的蛋白质孵育进行检测，可以观察到蛋白质大小为70～100 ku，诱导处理后的pGEX-4T1-RPL2沉淀、上清和混合中均出现单一的信号条带，而未加IPTG诱导的pGEX-4T1-RPL2和空载体的蛋白样品中未见信号表达（图7）。此结果进一步表明载体构建成功，水稻OsRPL2蛋白质成功并高效表达，并且该外源蛋白质可以得到可溶性和包涵体两种表达形式。

3 讨论

目前有一系列关于核糖体蛋白质的报道与研究[5-8]，核糖体广泛的存在于高等生物的叶绿体、线粒体和细胞质中。同时生物体需要大量的核糖体蛋白质来组装成为核糖体，才能为正常的生命活动提供保障[7]。由此可见核糖体蛋白质是核糖体的重要组成部分，许多的核糖体蛋白质不仅结构上具有功能，同时也是翻译过程中必不可少的因子，对细胞的增殖、分裂及分化起到重要的调节作用[4]。顾志敏等[10]首次从单子叶的模式植物水稻中克隆了核糖体蛋白质S7基因，证明了核糖体蛋白质在进化过程中的高度保守性。Yao等[11]成功分离了小麦中的15个核糖体蛋白质基因，并分析了其序列特性并进行了表达模式的检测。

本研究的OsRPL2基因是一个水稻核糖体蛋白质基因，其来源于武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室的前期研究，由构建的水稻粤泰A品种cDNA文库鉴定得到。为了进一步研究其功能及作用机理，作者提取了水稻粤泰A品种的RNA，利用反转录试剂盒反转录得到cDNA并进一步扩增获得了OsRPL2基因的cDNA序列。根据序列分析的结果，水稻OsRPL2基因与多个植物核糖体蛋白质L2基因具有较高的相似性并具有较高的保守性，这点和其他已经报道过的水稻核糖体蛋白质基因相似[12]。同时其编码的OsRPL2蛋白质具有2个与核糖体蛋白质功能相关的功能域，为进一步的功能分析提供了线索和帮助。在此基础上，以OsRPL2基因的cDNA序列为模板成功构建了pGEX-4T1-RPL2的原核表达载体，并通过考马斯亮蓝染色和Western blot检测证实了通过IPTG诱导，核糖体蛋白质OsRPL2在混合液、上清及沉淀中均有表达，说明了其为部分可溶性蛋白质。因此本研究的结果为后续研究奠定了基础，可以更加深入地探究核糖体OsRPL2基因的功能和作用。

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