曹玲丽 余马 舒晓燕 侯大斌

摘要：优化了薄层色谱条件，并建立生附子薄层色谱指纹图谱，便于快速准确评价生附子质量。结果表明，以正己烷/乙酸乙酯/甲醇（6.4∶3.6∶1.0，V/V/V）为展开剂，硅胶板-展开剂双重氨蒸气饱和20 min，并在氨蒸气环境下展开，喷稀碘化铋钾溶液显色，薄层色谱图效果最佳。生附子薄层色谱图指纹图谱共有7个特征斑点，斑点颜色深浅与HPLC含量测定结果基本相符。薄层色谱法可用于生附子生产实际中的质量初步评价，结果准确可靠。

关键词：生附子；薄层色谱；高效液相色谱；质量评价

中图分类号：O658.1+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2738-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.047

Research on Fingerprint and Quality Evaluation of Aconite Roots Using

Thin-Layer Chromatography

CAO Ling-li1，YU Ma1，SHU Xiao-yan1，HOU Da-bin1，2

（1.College of Life Science and Engineering， Southwest Science and Technology University， Mianyang 621000， Sichuan， China；

2.Engineering Research Center for Biomass Resource Utilizaiton and Modification of Sichuan Province， Mianyang 621000， Sichuan，China）

Abstract： Improve TLC condition and establish TLC fingerprint of aconite roots as well as appraising its quality preliminarily. The results showed that under the condition of high ammonia， normal hexane-ethyl， acetate-methanol（6.4∶3.6∶1.0，V/V/V） as developing solvent and final visualization with diluted iodized bismuth potassium solution， the effects of TLC were optimal. Additional， the TLC fingerprint of 8 batches of aconite roots had 7 common characteristic spots. Moreover，the colors of the spot simulation match well with the content of 3 diester-type alkaloids. The method provided a specific，exact and simple way to control the quality of aconite roots and its products.

Key words：aconite roots；thin layer chromatography （TLC）；high performance liquid chromatography （HPLC）；quality evaluation

生附子为毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaelii Debx.）的子根，味辛、甘，性大热，具有回阳救逆、补火助阳、逐风寒湿邪的功效[1]，是著名四川道地药材。生附子中主要活性成分乌头碱类化合物的临床药效显著[2]，也常作为杀虫剂在农业领域广泛应用[3]，生产研究中常将生物碱含量的高低作为评价生附子质量的重要指标，且多采用高效液相色谱法（HPLC）[4-7]，但此法对仪器要求高，成本较高，在实际生产中难以广泛应用，因此寻求快速、准确的检测方法是非常必要的。

薄层色谱法常用于快速分离和定性分析，这种技术所使用的设备和操作比较简便，可行性较高[8]。目前薄层色谱指纹图谱已被广泛用于苍术[9]、何首乌[10]、穿心莲[11]、当归[12]、吴茱萸[13]等众多中药材的种源鉴定及质量评价。

本研究通过参考2010年版《中华人民共和国药典》（下称《中国药典》）及附子薄层色谱相关研究优化生附子薄层色谱条件，以8份生附子为材料，3种双酯型生物碱为对照，建立了生附子薄层色谱指纹图谱，并为生附子质量的初步评价提供准确快捷的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

前期在四川江油附子种质资源中筛选的8份特异性较强的生材料，并经GAP种质资源圃进一步繁育，于2013年12月集中种植于西南科技大学试验基地。生附子材料编号为H1—H8，种植行长1.5 m，行距0.3 m，每行8株，株距0.1 m。生附子材料均由西南科技大学生命科学与工程学院侯大斌教授鉴定，为乌头的子根，生附子材料来源见表1。生附子于2014年7月采收，先自来水清洗泥土，再去离子水漂净，切片，105 ℃烘30 min，65 ℃烘至恒重，打粉过80目筛，备用。

1.2 仪器与试剂

仪器：薄层层析硅胶板（G型）；2 μL薄层毛细点样管；Varian1200LC/MS高效液相色谱仪（美国Varian公司）；KQ5200B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（BUCHI公司）。

试剂：新乌头碱、乌头碱、次乌头碱标准品购于中国药品生物制品检定所；乙腈、乙二胺为色谱纯，水为去离子水，其余试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 生附子薄层色谱条件考察 按2010年版《中国药典》[1]附子鉴别项下薄层色谱方法配制对照品溶液及供试品溶液，对照品溶液为3种生物碱标准品（浓度均为1 mg/mL）。以4份供试品（H1～H4）为材料，采用单因素法考察氨蒸气饱和方法，展开剂及显色剂，得到生附子薄层色谱最优条件。单因素考察条件见表2。

1.3.2 生附子薄层色谱指纹图谱的构建 按“1.2.1”项下的生附子最优薄层色谱条件对8份生附子供试品进行薄层色谱分析，每份材料3次重复，分析生附子共有特征斑点，建立生附子薄层色谱指纹图谱。比较与生物碱对照品相对应斑点的颜色差异，分别以数字1、2代表浅、深两个颜色等级。

1.3.3 HPLC色谱法测定生附子生物碱含量 采用HPLC法[14]制备3种标准品的标准曲线，并同时测定8份生附子3种生物碱含量，每份材料重复3次。

2 结果与分析

2.1 生附子薄层条件考察结果

2.1.1 氨蒸气饱和方法考察 在展开时间相同的情况下，硅胶板-展开剂氨蒸汽双重饱和20 min后，立即在氨蒸气环境下展开的薄层效果最好，分离度较好，斑点清晰，斑点形状圆整，无拖尾现象，这是由于生附子主要成分生物碱显碱性，G硅胶板显弱酸性，两者在硅胶色谱板上能形成盐而使Rf值很小或形成复斑[15]，因此保证展开环境的充分碱性，展开效果较佳。

2.1.2 展开剂考察 《中国药典》中的正己烷/乙酸乙酯/甲醇（6.4∶3.6∶1.0，V/V/V）展开剂展开效果较好，在相同时间内，分离度合适，最高斑点和最低斑点的Rf值分别为0.34和0.81，展距适宜，符合《中国药典》的规定。

2.1.3 显色剂考察 稀碘化铋钾显色效果较好，斑点清晰，且喷雾法操作快捷简便；10%硫酸-乙醇显色剂显色效果较差且显色斑点数较少。前者作为显色剂专一性较强，对于碱性较强的生物碱成分显色灵敏[16]，后者作为显色剂是利用其氧化性，高温下生物碱氧化加剧而呈现紫色斑点，相同条件下两种显色结果比较，前者显色效果较佳，斑点颜色清晰，容易辨别。

2.1.4 生附子最佳薄层色谱条件 最佳色谱条件为硅胶板-展开剂双重氨蒸气饱和20 min，并在氨蒸气环境下以正己烷/乙酸乙酯/甲醇（6.4∶3.6∶1.0，V/V/V）为展开剂密封展开40 min，展距为9 cm，稀碘化铋钾显色。此薄层色谱条件下重复3次，薄层色谱图效果稳定良好。裴妙荣等[17]对乌头碱薄层色谱的研究表明其Rf值与氨蒸气饱和时间在30 min内呈线性关系，超过此时间范围，Rf值也随之增大，乌头碱斑点也随之扩散，本试验过程也证明了此观点，因此氨蒸气环境下展开时间不能过长，40 min较为合适。同时本试验过程中所用硅胶板充分干燥，展开环境严格密封，薄层色谱层析环境相对稳定，保证了生附子薄层色谱结果的可重复性。。

2.2 生附子薄层色谱指纹图谱的建立

8份生附子供试品薄层色谱图的7个共有斑点代表了生附子提取液中7种生物碱物质，其中4、5、7号斑分别为标准品新乌头碱、乌头碱、次乌头碱，其余特征斑成分待进一步指示。7个斑点颜色深浅不一，表明7种成分含量的显著差异，7个特征斑共同构成了生附子薄层色谱指纹图谱（图1）。8份生附子3种生物碱斑点的颜色深浅表现出显著差异，4号斑颜色等级分别为1、2、1、1、2、1、1、2；5号斑颜色等级分别为1、2、1、1、2、1、1、2；7号斑颜色等级分别为1、1、1、2、2、1、2、2。

2.3 HPLC色谱法测定生附子生物碱含量

3种生物碱标准品以平均峰面积对质量浓度（mg/L）进行线性回归，在一定范围内线性关系良好，根据回归方程测定8份生附子3种生物碱含量（表3、表4）。

2.4 HPLC色谱法与薄层色谱法结果比较

薄层色谱结果中3种生物碱对应斑点的颜色深浅程度与HPLC色谱法精确定量的结果初步相符，并且两种方法相比较，薄层色谱法操作简单快速，成本较低，这表明通过薄层色谱法初步判断双酯型生物碱含量有其独特优势，可以为附子生产上的高含量双酯型生物碱品种的初步筛选及进一步研究提供准确、便捷的方法。

3 小结与讨论

附子是重要的商品药材，目前以生物碱为标准评价生附子质量的相关指纹图谱研究主要侧重于HPLC法，但HPLC法操作复杂，分析成本高，实际生产研究中难以广泛应用。薄层色谱指纹图谱有快速、灵敏度高、成本低、操作方便、专属性强的优点，严格控制操作过程与环境，同样可以进行较为准确的含量测定，能够为生附子在实际生产中的应用提供准确、便捷的方法。本研究丰富了生附子指纹图谱研究，为实际生产中生附子的质量初步评价提供科学依据。

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