张妮 王家胜 孔琪 余正文 乙引

摘要：通过单因素试验和正交试验对金雀花（Parochetus communis Buch.）异黄酮提取工艺中提取溶剂类型、提取剂体积分数、提取时间、提取温度、料液比等影响异黄酮提取率的因素进行了探讨，应用紫外分光光度法测定不同提取条件下金雀花异黄酮的含量。确定金雀花异黄酮最佳提取工艺参数为甲醇体积分数65%，提取温度90 ℃，料液比为1∶40（m/V，g∶mL），提取2次，每次2.0 h，在此提取工艺条件下，金雀花总异黄酮得率为2.38%。

关键词：金雀花（Parochetus communis Buch.）；异黄酮；提取工艺；正交试验设计

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2715-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.041

Study on Extraction Technology of Isoflavones in Parochetus communis Buch.

ZHANG Ni， WANG Jia-sheng， KONG Qi， YU Zheng-wen， YI Yin

（College of Life Sciences， Guizhou Normal University， Guiyang 550001， China）

Abstract： Extraction technology of isoflavone in Parochetus communis have been studied with single factor test and orthogonal experimental design. Effects of extraction solvents types， the volume fraction of extraction solvent， the extraction time， solid-liquid ratio on extraction rate of isoflavones were investigated. The content of isoflavones in Parochetus communis under different extraction conditions was measured by ultraviolet spectrophotometer.The optimum extraction conditions for isoflavones in Parochetus communis were established as follows：65% methanol（V/V） as solvent， solid-liquid ratio 1∶40（m/V，g∶mL） ，reflux extraction at 90 ℃ for 2 times and 2.0 h for each time. The extraction rate of isoflavones in Parochetus communis was 2.38% under above-mentioned optimum extraction procession.

Key words： Parochetus communis Buch.； isoflavone； extraction technology； orthogonal experimental design

药食同源植物金雀花（Parochetus communis Buch.）别名生血草、一颗血，为蝶形花科（Papilionaceae）金雀花属（Parochetus）植物，主要分布在贵州省兴仁县、兴义市、普安县、毕节市、遵义市等地，生于1 800 m的山谷草地，云南、缅甸、印度、斯里兰卡、印尼也有分布。该药材性酸、涩、温，常用于治疗创伤出血、跌打骨折、外伤发热等。贵州省苗族民间用金雀花治疗各种毒疮，具有独特的疗效[1，2]。金雀花是云南西双版纳傣族同胞重要的野菜品种之一[3]，贵州省遵义市也有食用金雀花的习惯。

异黄酮具有抗氧化、抗紫外、降血糖和抗肿瘤等多种药理活性[4，5]。如芒柄花素是植物雌激素，其大量存在于蝶形花科植物中，如黄芪、红三叶草，具有治疗心血管疾病[6]、加速伤口愈合[7]、抗高血压、抗氧化和雌激素[8，9]的作用。目前，金雀花中异黄酮提取工艺研究鲜见报道。本研究以异黄酮含量为指标，通过正交试验设计优选异黄酮类化学成分的提取工艺，为金雀花的开发和合理利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料金雀花于2012年6月采自贵州省兴仁县，经贵阳中医学院陈德媛教授鉴定为蝶形花科金雀花属植物金雀花的全草。其标本保存于贵州师范大学生命科学学院。芒柄花素为自制，结构经1HNMR、13CNMR、EI-MS鉴定，纯度经HPLC检测达到95%以上。

1.2 试剂与仪器

752E UV-Vis Spectrophotometer（天津普瑞斯仪器有限公司），电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司），EYELA N-1100型旋转蒸发仪（倍捷科技有限公司），SHZ-D（Ⅲ）循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司），AB135-S型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司），DHG-9140A型鼓风干燥箱（上海慧特仪器制造有限公司）；石油醚、甲醇、无水乙醇为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 金雀花的前处理及脱脂 取金雀花样品于60 ℃烘箱中干燥3 h，粉碎后移入干燥器中。分别称取金雀花1.000 0 g，用滤纸包好，置于索氏提取器中，以石油醚为脱脂剂，于85 ℃脱脂6 h，充分除去样品中游离脂类和脂溶性色素，再将滤纸包置于烘箱中60 ℃烘干。

1.3.2 金雀花异黄酮提取液的制备 取上述已脱脂好的金雀花样品，采用回流提取法进行提取；减压回收溶剂得到提取物浸膏，待用。

1.3.3 测定波长的选择 精密量取供试品溶液和对照品溶液适量，在190～800 nm对供试样品溶液和对照品溶液扫描，供试品和对照品均在249 nm处有最大吸收峰，故确定249 nm为测定波长。

1.3.4 标准曲线的制作 精密称取芒柄花素标准品0.000 50 g，置于25 mL容量瓶中，以95%的甲醇溶解，定容至刻度，摇匀。分别精密吸取150、200、300、400、500、600、700 μL标准品溶液，置于10 mL容量瓶中，再各加甲醇1 mL，最后用蒸馏水定容至刻度，摇匀。以1 mL甲醇加蒸馏水定容至10 mL为空白对照，在249 nm处测定其吸光度。以吸光度（y）为纵坐标，对照品质量浓度（x）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 y=0.041 6x-0.005 3，R2=0.999 5（n=7），表明芒柄花素浓度为3～14 μg/mL时呈良好的线性关系。

1.3.5 金雀花异黄酮提取率测定 取“1.3.2”浸膏用甲醇定容至一定体积得样品提取液，摇匀，按“1.3.3”的方法进行异黄酮含量的测定，再根据标准曲线计算得样品中异黄酮质量，异黄酮提取率=m/M×100%。式中，m为样品中异黄酮质量；M为金雀花粉末质量。

1.3.6 单因素试验及正交试验设计 试验考察了水、不同体积分数乙醇及甲醇对金雀花异黄酮提取率的影响。在此基础上，通过对提取参数中甲醇体积分数、回流温度、料液比（m/V，g∶mL，下同）及回流时间等影响金雀花异黄酮提取率的因素进行单因素试验及正交试验，确定最佳的工艺参数（表1）。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取溶剂对异黄酮得率的影响 取金雀花样品1.000 0 g，分别以水、甲醇、乙醇为提取溶剂，在温度为85 ℃，料液比为1∶20，提取2次，每次2.0 h的条件下，考察提取溶剂对金雀花异黄酮得率的影响，结果见图1。由图1可知，随着乙醇体积分数的增加，金雀花中异黄酮得率呈下降趋势。当甲醇体积分数为60%时，异黄酮得率最高，明显高于乙醇提取，远高于水提取。说明在此浓度下，异黄酮类化合物在甲醇溶液中的溶解度要高于在乙醇溶液和水中的溶解度。由于异黄酮类化合物具有多个苯环和酚羟基结构，苯环为非极性基团，而酚羟基为亲水基团，具有极性，所以金雀花异黄酮适宜用一定碳链长度的适宜极性的混合溶剂提取。当甲醇体积分数超过60%时，提取液的颜色加深，各种杂质的溶出液增多，给后续的紫外分光光度计测量带来较大的干扰。因此，选择体积分数55%～65%的甲醇溶液作为进一步优化的范围。

2.1.2 回流时间对异黄酮得率的影响 取金雀花样品1.000 0 g，以体积分数60%的甲醇为提取溶剂，提取温度为85 ℃，料液比为1∶20，提取2次，考察回流时间对异黄酮提取过程的影响，试验结果见图2。由图2可以看出，在回流时间低于2.0 h时，异黄酮得率随着时间的延长而大幅度增加，大于2.0 h后，异黄酮得率随回流时间的延长而降低。因此选取回流时间为1.5～2.5 h即可。

2.1.3 回流温度对异黄酮得率的影响 取金雀花样品1.000 0 g，以体积分数60%的甲醇为提取溶剂，料液比为1∶20，提取2次，每次2.0 h的条件下，考察回流温度对异黄酮得率的影响，试验结果见图3。由图3可以看出，异黄酮得率大体趋势呈随回流温度升高而提高的趋势。说明温度越高，分子运动越快，渗透、扩散、溶解速度加快，使异黄酮类化合物更容易从细胞中转移到溶剂中。但温度过高，异黄酮类可能会被氧化或者其中的成分被破坏。因此，选择回流温度80～90 ℃为进一步优化的范围。

2.1.4 料液比对异黄酮得率的影响 取金雀花样品1.000 0 g，以体积分数60%的甲醇为提取溶剂，在温度为85 ℃，提取2次，每次2.0 h的条件下，考察料液比对异黄酮得率的影响，试验结果见图4。如图4所示，随着溶剂用量的增大，异黄酮得率逐渐增大，当溶剂用量再增大时，异黄酮得率处于下降趋势。一般来说，溶剂用量越大，提取率越大；但是，过大的溶剂用量会溶解出更多的杂质，也会造成溶剂和能源的浪费，并给后序的处理带来困难。综合考虑异黄酮得率、溶剂用量和能源损耗等因素，选择料液比（1∶20）～（1∶40）为进一步优化的范围。

2.2 正交试验结果

在单因素试验的基础上，以金雀花干粉为样品，对影响提取效果的主要因素进行L9（43）正交试验，同时对试验结果进行了方差分析，结果如表2所示。由表2的R可以看出，各因素对试验结果影响的主次顺序为料液比（D）、回流时间（B）、甲醇体积分数（C）、回流温度（A），且方差分析结果表明，回流时间及料液比对浸出物得率影响显著（P<0.05）。依据正交试验可得最佳工艺条件为A3B2C3D3，即体积分数65%的甲醇为溶剂，回流温度90 ℃，加热回流2.0 h，料液比1∶40，在此提取工艺条件下，金雀花异黄酮得率的验证结果为2.38%。

3 小结

金雀花是一种药食兼用的重要特色植物资源，含有丰富的异黄酮，值得深入研究开发应用。本研究通过单因素试验及正交试验，确定金雀花异黄酮最佳提取工艺参数为甲醇体积分数65%，提取温度90 ℃，料液比1∶40，提取2次，每次2.0 h，在此提取工艺条件下，金雀花总异黄酮得率为2.38%。

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