杨培奎 张振霞 沈浩铎 施伟斌 查广才 庄东红 郑玉忠

摘要：为了分析广东某狮头鹅种鹅场鹅卵黄性腹膜炎的病原，从病死雌性种鹅中分离得到1株菌株。通过细菌培养形态、镜检、生化鉴定以及16S rRNA基因序列同源性比对，确定分离的菌株为大肠杆菌。抗生素和中草药水提取物对分离菌株的药敏试验结果表明，恩诺沙星、头孢噻肟和中草药丁香对分离菌株的抑制和杀灭效果最好。用分离菌株制备的灭活疫苗，经无菌检测、试验动物安全性和免疫效果检验，结果表明，该疫苗是安全的，并对试验动物具有一定的免疫保护作用。

关键词：狮头鹅；卵黄性腹膜炎；大肠杆菌；分离鉴定；药敏试验；灭活疫苗

中图分类号：S835 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2679-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.032

Isolation and Indentification，Drug Sensitivity Test and Inactivated Vaccine Development of Escherichia coli from Shitou Geese

YANG Pei-kui1，ZHANG Zhen-xia1，SHEN Hao-duo2，SHI Wei-bin3，ZHA Guang-cai1，

ZHUANG Dong-hong1，ZHENG Yu-zhong1

（1. Hanshan Normal University， Chaozhou 521041， Guangdong， China； 2. Guangdong Chaozhou Agricultural Science and Technology Development Center， Chaozhou 521011， Guangdong， China； 3. Chaoan Fengtang Weibin Farm， Chaozhou 515646， Guangdong， China）

Abstract： In order to analyze the pathogen of yolk peritonitis in Shitou geese，a strain was isolated from a dead female goose in Guangdong province.The results showed that the strain was identified as E.coli based on morphology，biochemical characters and phylogenetic analysis of 16S rRNA genes. Drug sensitivity test of the strain to antibiotic and Chinese herbal medicine extracts showed that E.coli was sensitive to Enrofloxacin，Cefotaxime Sodium and extracts from Eugenia caryophyllata. Inactivated vaccine prepared with the strain was proved safe and effective by sterility test， safety test and effect test.

Key words：shitou geese；yolk peritonitis；Escherichia coli；isolation and identification；drug sensitivity test；inactivated vaccine

狮头鹅原产于广东省粤东地区，是国内外最大的肉用型鹅种之一。虽然作为一种大型食草水禽，其具有饲养相对简单、饲料成本低、抗病能力强等特点，但是随着养殖规模的扩大，细菌性疾病不断出现，其中大肠杆菌病是常见的细菌性疾病。鹅卵黄性腹膜炎俗称“蛋子瘟”，是一种常见于产蛋鹅的细菌性传染病，主要由大肠杆菌侵害成年鹅的生殖器官引起。该细菌性传染病主要发生于种鹅产蛋期，发病时会造成产蛋率急剧下降甚至死亡，常造成巨大的经济损失，严重影响养鹅业[1]。

传统的细菌鉴定主要依据形态、生化以及免疫等检查结果。随着分子生物学技术的进步，基于PCR和基因测序的分析技术也大量地应用于细菌的分离和鉴定，如Woese等[2]提出的利用16S rRNA基因的同源性分析原核生物的进化和系统发育。由于16S rRNA的遗传较为稳定且序列信息量适中，同时目前已经报道的细菌16S rRNA达400万多个，因此通过16S rRNA的序列分析，可以将细菌鉴定到属或种。

本研究对广东省潮州地区某狮头鹅种鹅场因鹅卵黄性腹膜炎致死的雌性种鹅进行细菌分离，在传统形态和生化分析的基础上结合16S rRNA基因序列比对进行细菌鉴定。同时，利用常用抗生素和中药提取物针对分离的病原菌进行药敏试验，并尝试灭活疫苗的制备研究，以期为狮头鹅大肠杆菌病的预防和治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 广东省潮州市某狮头鹅种鹅场病死的雌性种鹅，采集其肝脏、心血、胰脏、腹腔积水等。

1.1.2 试剂 大肠杆菌生化鉴定条为青岛海博生物技术有限公司产品，麦康凯琼脂为广东环凯微生物科技有限公司产品；琼脂糖为Biowest公司产品、DNA Marker（DL2000），PCRmix Taq为广州昂科生物科技有限公司产品；Sanprep柱式DNA回收试剂盒为生工生物工程（上海）股份有限公司产品。

1.1.3 引物合成 根据文献[3]提供的细菌16S rRNA基因引物序列设计引物，16S上游引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′，16S下游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养 取病死雌性种鹅的肝脏、心血、胰脏、腹腔积水等接种于麦康凯琼脂平板上，37 ℃培养24 h，观察细菌的菌落形态特征，并进行涂片，革兰氏染色镜检，观察其形态结构及染色特性[4]。

1.2.2 生化试验 将麦康凯培养基上分离纯化的菌株接种于LB液体培养基，200 r/min 37 ℃培养8 h，取一定量的菌液接种于大肠杆菌生化鉴定条的反应管，具体操作按产品说明书的操作步骤进行，并在37 ℃培养箱中培养24 h后判断结果。

1.2.3 分离菌株16S rRNA基因的克隆及序列分析 将分离纯化得到的菌株接种于LB液体培养基，并200 r/min 37 ℃培养8 h，取1 μL菌液作为模板进行菌液PCR。用16S rRNA引物进行PCR扩增，反应程序为：94 ℃预变性4 min； 94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存 12 h。PCR产物利用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收后送至华大基因公司测序，测序结果利用Blast进行同源序列比对和进化树的绘制。

1.2.4 药敏试验 采用二倍稀释法[5，6]测定8种抗生素（红霉素、氨苄霉素、庆大霉素、万古霉素、强力霉素、土霉素、恩诺沙星和头孢噻肟）和4种中药（丁香、五味子、八角、山萸肉）的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）。取96孔培养板，将每种药物作为一组，每组12孔，向第1号孔加入300 μL液体培养基，其余11孔每孔加入200 μL液体培养基，再向1号孔加入100 μL药液，充分混匀后，从1号孔中取出200 μL放入2号孔，以此类推，然后从11号孔吸出200 μL弃去，再向12个孔中各加入10 μL菌液（2×107 CFU/mL）。置于37 ℃培养箱中培养24 h，然后取出观察。凡是药物最高稀释孔中无菌生长，且在加入MTT（5 μL，5 mg/mL）37 ℃孵育30 min未变蓝色的，该孔的药物浓度即为该种药物对该菌的最小抑菌浓度（MIC）。在MIC的基础上，取无明显细菌生长的各孔培养液涂布于LB琼脂平板，置于37 ℃培养箱中培养48 h观察结果。平板上无菌生长且药物浓度最低的，即为该药物对该菌的最低杀菌浓度（MBC）。

1.2.5 灭活菌苗的制备及免疫检测 参照文献[7]并做适当改进，将分离得到的菌种接入LB液体培养基，置于恒温摇床200 r/min，37 ℃培养24 h，然后用琼脂平板计数，并用无菌生理盐水将细菌浓度调至2×1010 CFU/mL。向菌液中加入一定量的甲醛溶液，并使其终浓度为0.3%，置于恒温摇床200 r/min，37 ℃培养48 h。将灭活菌苗与等体积的无菌氢氧化铝胶溶液充分混合后备用。取一定量的铝胶佐剂灭活疫苗分别接种于LB琼脂培养基和麦康凯培养基中，37 ℃培养48 h，进行无菌检验。

1.2.6 攻毒试验 随机挑选20只健康小白鼠均分为两组，试验组采用腹腔注射的方式接种0.4 mL铝胶佐剂灭活疫苗；另外10只小鼠作为对照组，分别注射0.4 mL的灭菌生理盐水，连续7 d观察小鼠的进食、活动以及发病情况。7 d后对所有小鼠统一接种0.4 mL（2×1010 CFU/mL）含有活菌的菌液，进行菌苗的免疫攻毒测定。

2 结果与分析

2.1 细菌的分离和形态观察

从病死雌性种鹅分离到一株疑似大肠杆菌，命名为A菌株。A菌株在麦康凯培养基上生长为边缘整齐、隆起、表面光滑湿润的圆形红色菌落（图1），经革兰氏染色镜检为阴性（图2），且呈两段钝圆的短杆菌，初步判断为大肠杆菌。

2.2 生化鉴定及16S rRNA序列分析的结果

将A菌株接种于肠杆菌科生化鉴定试剂盒，生化反应结果符合肠杆菌科细菌特征（表1）。由表1可知，该菌株对靛基质和甲基红试验呈阳性反应；对柠檬酸盐和VP反应呈阴性反应。该结果符合大肠杆菌的生化试验特性。

利用16S rRNA基因引物对A菌株进行菌液PCR扩增，得到约1.5 kb的惟一DNA片段。PCR产物经电泳检测后进行产物回收和测序。结果表明A菌株的16S rRNA长度为1 378 bp，经过与GenBank数据库中的与16S rRNA序列进行相似性分析，A菌株与E.coli的16S rRNA基因序列的同源性高达99%，因此判定A菌株为大肠杆菌，其系统发育树如图3所示。

2.3 细菌对抗生素和中草药水提物的敏感性

由表2可知，A菌株对于供试的8种抗生素的敏感性存在很大的差别。其中，庆大霉素的MIC和MBC超过了试验设计的浓度范围，即MIC和MBC均超过2 500 μg/mL；而A菌株对恩诺沙星和头孢噻肟非常敏感，恩诺沙星对A菌株的MIC和MBC均达到1.563 μg/mL；头孢噻肟对A菌株的MIC和MBC也达到3.125 μg/mL。氨苄霉素的MIC和MBC均为625 μg/mL；红霉素、万古霉素对A菌株的抑菌效果一致，MIC和MBC均为312.500 μg/mL；土霉素的MIC和MBC均为125 μg/mL。供试的8种抗生素中恩诺沙星的抑菌和杀菌效果最佳，头孢噻肟次之，而庆大霉素的效果最差。

中草药水提物对A菌株的抑制和杀灭效果如表3所示。由表3可知，丁香的效果最佳，其MIC和MBC分别为0.864 mg/mL和1.729 mg/mL；五味子的效果次之，MIC和MBC均为2.842 mg/mL；八角的抑菌和杀菌效果最差。由结果可知，抗生素恩诺沙星、头孢噻肟以及中草药丁香对于A菌株的抑制或者杀灭效果显著，因此可以用于该类型病原菌的防治。

2.4 灭活疫苗的免疫效果

A菌株的铝胶佐剂灭活疫苗接种于LB琼脂培养基和麦康凯培养基后在37 ℃培养48 h，未发现有细菌生长；腹腔接种于小鼠后，未发现小鼠精神萎靡或者食欲下降等情况，注射部位也未见肿胀、化脓等异常表现，且存活率达到100%，表明此次制备的A菌株铝胶佐剂灭活疫苗具有较高的安全性。

2.5 攻毒试验

攻毒试验结果表明，虽然免疫组小鼠在攻毒后出现短暂的精神萎靡以及24 h内有2只小鼠死亡的情况，但是对照组小鼠在攻毒24 h后出现9只小鼠死亡。因此接种A菌株铝胶佐剂灭活疫苗对于有机体抵御致病性A菌株的攻击具有一定的作用。

3 讨论

有研究指出利用16S rRNA鉴定细菌时，同属细菌的16S rRNA基因的序列同源性应至少在97%以上[8]，而徐朋朋等[9]在鉴定鸡源大肠杆菌时发现，分离的大肠杆菌与同科的志贺菌属的16S rRNA保守序列相似度达到了99%。因此，在大肠杆菌时将传统鉴定方法和分子方法结合十分必要。本研究中，分离菌株在特异显色培养基形态学特征，革兰氏染色镜检及生化鉴定结果均符合大肠杆菌的特征，其16S rRNA基因序列经比对与NCBI数据库中大肠杆菌16S rRNA的同源性高达99%，因此可以确定分离纯化的菌株是大肠杆菌。

药敏试验结果表明，8种供试的抗生素中恩诺沙星和头孢噻肟对该菌株的抑制和杀灭效果最明显，而氨苄青霉素和庆大霉素的效果最差。该结果与同类研究相比不完全一致，吴建忠等[10]在鸡大肠杆菌的药敏试验中发现先锋噻肟（亦称“头孢噻肟”）为极敏药物，氨苄青霉素和庆大霉素则为中敏药物；胡方建等[11]发现鹅大肠杆菌对恩诺沙星高度敏感，对庆大霉素中度敏感。因此，不同来源的大肠杆菌对抗生素的敏感性是有差异的，所以在临床中进行药敏性试验对于科学合理的使用抗生素药物具有重要的参考意义。本研究还对中草药水提液对大肠杆菌抑制和杀灭效果进行分析，结果表明丁香的效果最佳。单一抗生素的长期使用易导致微生物的耐药性，而中草药提取物虽然成分复杂但是可以达到多靶点杀菌的效果，进而减少或者避免耐药性的产生。因此，如能在养殖过程中合理使用抗生素药物和中草药，对于减少抗生素使用，减低耐药性，提高细菌性疾病的预防和治疗具有重要的价值。

由于各地鹅源致病性大肠杆菌血清型较多，且缺乏系统研究，因此分离本地区流行菌株，筛选免疫源性好的菌株制备灭活疫苗，是防治该病原菌切实有效的途径[12]。本研究利用氢氧化铝胶与灭活的细菌培养液混合制备铝胶灭活疫苗，采用腹腔注射后能很好地为机体吸收，对试验动物生长及活动无不良影响。采用致病菌攻毒试验检验免疫效果，表明疫苗具有一定的免疫保护性。

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