文图/《中国医药科学》记者 费 菲 曲莉莉

开拓创新、共谋发展，以基础研究促临床疗效
——第六届中国眼科学基础研究大会暨研究生导师论坛侧记

文图/《中国医药科学》记者 费 菲 曲莉莉

业界关注

“三月初的北京大学，已呈现出迎春花盛开、山桃花含苞待放的初春美景；未名湖畔、博雅塔旁，处处可见生机勃勃的景象。趁着此次论坛召开的东风，我国眼科界迎来了科学研究的新的春天！”

本次论坛组织委员会主席、中华医学会眼科学分会名誉主任委员黎晓新教授在开幕式上如是说。

她表示，每年一届的眼科学基础研究大会，是对一年来眼科科研工作的一次大检阅，是大家交流经验、切磋技艺的平台。今年大会增添了诸多亮点，非常荣幸地请到三位院士以及美国、新加坡等国际友人为我们传授经验，使我们扩展科研视野、激发科研灵感。“开拓创新、共谋发展”是我们这次会议的主题。我们力求把论坛办得充实而实用——这次会议上，南加州大学Doheny眼科研究所的DavidHinton教授介绍胚胎干细胞诱导的RPE单层在干性AMD的治疗进展；纽约哥伦比亚大学的StepenTsang教授讲解伪装成AMD的一组疾病；新加坡基因组研究院人类遗传学首席研究员 KhorChieaChuen博士讲授亚洲老年黄斑变性（AMD）的遗传；香港中文大学的彭智培教授讲近视的遗传；南加州大学ShikunHe教授介绍干性AMD发病机制中Sirt的作用；国际眼科学院士PinarAydin教授现场讲述SCI论文的书写，并现场辅导5篇摘要和5篇全文，提高大家的论文写作能力。本次论坛还安排了动物实验专题，有科研汇报和展板等各种形式的交流，必将起到提高科研素质，共享经验和开阔视野的效果。

黎晓新教授：眼底病中，血管生成因子与炎症因子如何起作用？

据黎晓新教授介绍，在最近几年的流行病调查中可以看出，老年黄斑变性（AMD）患者在50岁以上的人群中患病率较高，为27%，与白内障26%的发病率基本相当，逐渐上升为国内老年人致盲的第一位原因。我们对AMD的认识是基于各阶段的病理性改变。AMD的临床表型是不同的，早期AMD都以玻璃膜疣（drusen）的沉积为特征，位于内膜上层的小胶质细胞就游离进入视网膜色素上皮细胞（RPE）层，Bruh膜随之增厚，同时位于脉络膜层的巨噬细胞也开始向RPE区聚集，逐渐走向脉络膜毛细血管的萎缩。

在AMD的早期和中期形成了玻璃膜疣的沉积、巨噬细胞和小胶质细胞聚集，以及Bruch膜增厚的改变。这种改变导致了两种病理反应：一种是激发的炎症反应，一种是激发的低氧性的代谢性改变。如果发生了RPE的融合，逐渐产生了继发视细胞变性，最后走向脉络膜细胞的萎缩，这是AMD的干性改变。我们国人更常见的是湿性的改变，也包括前一段这些细胞的聚集，Bruch膜的增厚，它刺激了炎性因子和血管生成因子，所以导致了这种AMD湿性改变。

我们在“973”课题中，关于这部分研究有一些设计。正常情况下，视锥细胞和视杆细胞的膜盘不断脱落和再生，视网膜色素上皮（RPE）细胞不断吞噬脱落的视细胞膜盘，这就呈现出一种正态的稳态反应。如果某些因素使刺激增强，就会表现到补体通路、炎症小体、细胞内的一些物质及血管生产因子。这些物质的产生，使RPE走向不可逆的损伤，可能走向干性或是湿性。在干性方面是以炎症因子为主，在湿性方面是以血管生成因子为主。简言之，在老年黄斑变性的各个过程中，由于RPE吞噬功能的下降，导致了玻璃膜疣的沉积。巨噬细胞和小胶质细胞聚集以及Bruch膜增厚的改变，导致了两种病理反应——炎症反应因子和血管生成因子，导致了不同的表型——这是我们从病理学上看到的现象，那么，为什么有的人患病，有的人不患病？这就是基因的易感性造成的。

本课题组研究关于AMD各阶段的可能分子发病机制的主要内容：RPE复合体的损伤与保护机制，眼底新生血管AMD发病机制及干预策略。由于遗传与环境导致的RPE功能障碍而出现炎性反应和血管增殖反应。

对于AMD三大易感基因之一的补体因子（CFH），我们课题组也已发现并证实，在我国人群中，CFH与AMD相关，与国外样本保持了一致。为什么CFH会导致AMD的改变？我们发现还是与抗氧化相关的。在基因功能研究中发现，CFH的保护性基因型H402Y可显著增加CFH对氧化性脂类的结合能力，会导致一些病变的产生。H402Y抑制oxPLs与RPE细胞及巨噬细胞的结合力。这个研究为我们对整个疾病的基因控制中，其表型到底是与氧化应激关系更密切，还是与新生血管因子关系更密切，提供了进一步的研究线索。氧化特异性抗原-氧化性磷脂（oxPLs）可促炎性及新生血管因子：CD36，IL-6和VEGF表达。我们在机制研究中发现，应将遗传-氧化应激-免疫和新生血管进行有机联系。

AMD三大易感基因中，第二个主要基因是HTRA1。我们课题组把HTRA1转染到小鼠胚胎细胞里，生出来的小鼠可以看到其视网膜出现瘤样血管扩张。我们发现HTRA1与另外一种表型有一定的关联。我们又进一步做了细胞学形态研究，发现是通过下调纤维连接蛋白的表达。纤维连接蛋白的降低也证实了与PCV易感基因有关，息肉样脉络膜血管病变（PCV）主要表现为一种毛细血管瘤样扩张，主要是扩张在脉络膜毛细血管上。正如David Hinton教授讲到的——AMD的病变实际是复合体，是累积到RPE继发性地影响视细胞和脉络膜毛细血管复合体的病变。在湿性AMD中两种类型的改变，PCE和我们通常见到的非PCE的区别点就在于毛细血管的形态学差异。我们发现并证实：外显子测序验证了以往发现，同时发现了CNV的新位点。通过基因功能研究发现，HTRA1破坏血管壁，出现血管膨大病变。

AMD第三个主要的易感基因是ARMS2。它的作用至今不是十分明确。我们在细胞学研究中发现，它与新生血管的生成能力是相关的。如果ARMS2发生了基因突变，它就会使炎性反应增加，血管生成能力则下降，到底是什么细菌导致AMD，目前还不是十分清楚，这督促我们在这个领域里不断地做工作。我们验证了以往发现，并发现了nAMD新位点、PCV相关位点，及CNV与PCV差异位点（待验证）。通过基因功能研究发现，ARMS2突变型质粒转染细胞可影响血管内皮细胞和RPE细胞增殖、粘附及迁移等生物学行为；ARMS2突变型质粒转染RPE细胞可引起细胞内炎性反应。在机制研究中，我们发现了ARMS2与VEC血管生成之间建立联系。

第四个基因是Toll样受体（TLR3）基因，但目前机制不清，TLR3多态性保护AMD机制也不明确。基因功能研究发现：课题组证实dsRNA激活TLR3导致人干性AMD，TLR3 C1234T突变转染RPE细胞可导致TLR3与dsRNA结合力降低一半，从而起到对干性AMD的保护作用。

我们通过对AMD患者人群的筛查，课题组发现了AMD新基因——HERPUD1，发现并证实了HERPUD1 rs2217332与我国人群PCV关系密切。尽管经过大样本调查还没有完全证实它是PCV特有的，但在调查初期阶段，对PCV和AMD本身是在一种基因组里再进行细的分工，这在方法学上很不成熟。从功能学中把初筛中有一定的P值改变，但p值不是很高的一组基因，通过组织学去进行验证。基因功能研究发现：HERPUD1高表达于 PCV膜，HERPUD1可上调Amyloid beta，后者导致血管生成因子的表达。

对于在血管生成因子的高表达的湿性AMD中，我们如何探索这一部分发病机制，要从血管新生的生成机制中去寻找它的相关因子。血管新生最开始是有一个新芽萌出的改变，以后长出一个茎细胞，然后又分化出一个尖端细胞。而这些不同阶段都分别有各自的细胞因子去进行配合和作用。我们开展的工作就是对整个新生血管发生的不同因子参与过程的行为——存活、移行、增殖和血管的通透性，都做了研究。

我们也对VEGF之外，与VEGF有很强协同作用的一些因子进行了转化研究，并且申请了专利。我们对国内的康柏西普做了基础研究，特别是PED——VEGF的拮抗因子也做了转化研究。对于VEGF的不同亚型VEGF-A、VEGF-B等开展了很多研究，对它们的受体、炎症反应，以及血管生成之间的关系也做了研究和比较，发现了可能的研究线索。

随着国际上对AMD不同阶段发病的认识，大量的基础数据产生了很多研究，美国学者主要研究该国AMD发病最主要的类型——干性AMD。他们的补体通路抑制剂——C5抑制剂研究已经开始进入临床二期研究。由于抗VEGF的药物治疗都局限在抗体和受体上，目前的治疗都短效，这样给临床的干预带来了一定的问题。进一步的研究是从其下游进入到细胞内的转基因治疗，目前已经进入了一期研究；我们课题组也在开展一些相关研究。

谁来调控血管生成因子？我们最近在开展这项研究，还有很多工作需要完善，以便更好地控制这个过程，而不是被动地消除它已经产生的不良影响。

AMD的发生是一个复杂的多因素疾病，但大家共同的认识是，氧化应激反应后造成的RPE细胞的损害，以致RPE细胞功能的失常，是AMD发生的关键因素。在氧化应激反应的损害后，RPE细胞功能的失常促进了中子的形成，继发了局部的炎症反应，之后进一步加速了RPE细胞功能的损害——这是恶性循环，最后导致了AMD的发生。

南加州大学何世坤教授：干性AMD发病机理：Sirt1作用明确

关于AMD发病机理的问题，目前讨论非常多。我们从定义上可以发现，AMD的发生在人的生命的晚期，而不是早期。如果这个疾病完全是由遗传基因造成的，从理论上说，大部分应该在生命的早期就发病。我们已经从遗传学角度、基因敏感性等各方面开展了研究。那么，生活环境、整个细胞、微观和宏观的环境因素是否触发了AMD的发生？近几年，很热门的表观遗传学特别注重环境因素是如何诱发疾病发生的。AMD的表观遗传学研究刚刚起步，发表的文章较少，氧化应激反应与AMD的发生、以及表观遗传因素的交互反应在AMD发生中起了什么作用。我们拟从表观遗传学的角度来解释AMD发病机理，引起大家的关注。

表观遗传学是研究基因及其表型的改变，而不涉及DNA结构序列的改变，其研究实质就是对DNA表面的化学的改变，有的表观遗传学已经成为生物学研究的热点。一个人处在蓝天白云、营养均衡的生活中，身体会处于正常的基本状态。如果空气和水质被污染，生活压力很大，这样的生活会导致表观遗传学的改变，以致于造成基因异常的表达，导致肿瘤、糖尿病等一些疾病的发生。一些没法解释的疾病，也许可以从表观遗传学的研究角度获得解答，找到治疗的方法。表观遗传学对基因的调控作用主要体现在三方面：DNA的甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA 调控，它们之间可以是单独或相互作用的，基因在体内的上调和下调就是取决于这些主要因素交互反应后的结果。组蛋白修饰对基因的调控包括：乙酰化和去乙酰化，这两种过程都是在酶的调控下进行的。

正常情况下，组蛋白的乙酰化和去乙酰化的过程应保持平衡，如果乙酰化过度表达，会使基因转录受到了抑制。组蛋白对基因的修饰领域，目前的一个研究热点是关于去乙酰化酶研究。组蛋白去乙酰化酶（HDAC）可分为4大类、18个成分。我们研究的是第三类Sirtuins家族中的功能较明确的沉默信息调节因子1（Sirt1），它在AMD发病机理中究竟起到什么作用？现在还不清楚。

那么，Sirt1的功能究竟有哪些？它的功能很广泛——人的寿命的长短与Sirt1的表达多少有关、它是氧化应激反应的保护体、它与细胞衰老有关（如红酒可以促进 Sirt1的产生）等。

有的研究认为，Sirt1在抑制氧化应激反应中起到关键作用。氧化应激（OS）是自由基在体内产生的一种负面作用，是导致人体疾病和衰老的重要因素之一。正常情况下，氧化应激损害因子的产生和抑制因子应处于平衡状态，如果Sirt1的功能表达下降，以及其他抗氧化应激反应的因子下降后，就会产生自由基，造成严重的氧化应激损害。Sirt1在眼睛里的表达，可以从角膜移植到后面的视网膜，有很多细胞都有Sirt1的表达。其表达的广泛存在就说明它存在非常重要的作用，否则它不应该有Sirt1的表达。

究竟Sirt1能否保护RPE免受阳光应激反应的损伤？我们做了体外实验，培养了视网膜色素上皮（RPE）细胞，用Sirt1 mRNA敲除Sirt1基因，用tBH作为氧化应激反应诱导剂，随着剂量的增加，我们可以看到，Sirt1 mRNA的表达明显增高，超过了对照组。敲除Sirt1基因后，Sirt1的下游基因明显受到了抑制。

由此我们得出结论：表达的减少可能与网膜色素上皮细胞凋亡及干性AMD的发病有关。Sirt1是一个重要的抗氧化应激反应损伤的保护因子，上调Sirt1可能具有潜在预防干性AMD的作用。