方 勤，傅胜才

（1.湖南农业大学动物医学院，湖南长沙410128；2.湖南省畜牧兽医研究所，湖南长沙410131）

副猪嗜血杆菌作为一种机会主义菌种在免疫抑制性疾病感染的情况下危害较大，它是一种能引起浆液性纤维素性炎症的兼性厌氧的革兰氏阴性菌，主要影响一些缺乏免疫力的保育猪，发病率通常在10%～15%，严重时死亡率可达50%左右[2]。为了加快对副猪嗜血杆菌的分离鉴定，一些常规的实验方法是必不可少的。以此为出发点，对副猪嗜血杆菌做了一些初步研究。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 生化实验材料：葡萄糖、蔗糖、果糖、β-半乳糖苷、麦芽糖、蛋白胨水、尿素、新型微生物微量生化鉴定管、过氧化氢酶试剂、氧化酶试纸、靛基质试剂。

1.1.2 卫星生长现象材料：鲜血琼脂平板。

1.1.3 药敏实验材料：抗菌药物药敏纸片。

1.1.4 TSA固体培养基、TSB液体培养基[3]：

（1）1000mLTSA配制：胰酪胨大豆琼脂培养基42g，加入890mL蒸馏水，用NaOH调节PH至7.3左右，121℃高温蒸汽灭菌15min，恒温烘箱冷却至60℃，加入100mL新生牛血清（购自浙江某生物公司，后同）和10mL2g/L过滤除菌NAD，倒平板，4℃保存。

（2）1000mLTSB配制：胰蛋白胨大豆肉汤30g，加入890mL蒸馏水，用NaOH调节PH至7.3左右，121℃高温蒸汽灭菌15min，恒温烘箱冷却至60℃，加入100mL新生牛血清和10mL2g/L过滤除菌NAD，4℃保存。

1.2 试验方法

1.2.1 生化实验

1.2.1.1 氧化酶试验：将HPS的TSB液体培养基滴于氧化酶试纸上，观察颜色变化。

1.2.1.2 过氧化氢酶试验：将HPS的TSB液体培养基50μL用无菌注射器注入过氧化氢酶生化鉴定管中，30s后轻轻振荡，观察结果。

1.2.1.3 葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖生化鉴定：用少量冰醋酸注入各新型微生物微量生化鉴定管确定其变色是由紫色变无色再变黄色，然后在进行试验，挑取TSA培养基上的HPS单个菌落于TSB液体培养基中稀释至50μL，然后将这50μL稀释液用无菌注射器注入葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖新型微生物微量生化鉴定管（4种均注入50μL），37℃培养24～48h后观察颜色变化。

1.2.1.4 蛋白胨水生化鉴定：挑取TSA培养基上的HPS单个菌落于TSB液体培养基中稀释至50μL，然后将这50μL稀释液用无菌注射器注入蛋白胨水新型微生物微量生化鉴定管，37℃培养24～48h后加入靛基质试剂2～3滴，观察颜色变化

1.2.1.5 β-半乳糖苷生化鉴定：挑取TSA培养基上的HPS单个菌落于TSB液体培养基中稀释至50μL，然后将这50μL稀释液用无菌注射器注入β-半乳糖苷新型微生物微量生化鉴定管，37℃培养24～48h后观察颜色变化。

1.2.1.6 尿素生化鉴定：挑取TSA培养基上的HPS单个菌落于TSB液体培养基中稀释至200μL，然后将这200μL稀释液用无菌注射器注入尿素新型微生物微量生化鉴定管，37℃培养24～48h后观察颜色变化。

1.2.2 卫星生长现象：取5只灭菌EP管分别编号1，2，3，4，5。分 别 向 其 中 加 入200μL，100μL，100μL，100μL，100μLHPS的TSB液体培养基，用灭菌枪头沾取少量金黄色葡萄球菌至1号管打匀，然后吸取100μL至2号管打匀，再从2号管吸取100μL至3号管打匀，以此类推到5号管，最后从每只EP管中吸取100μL菌液分别在鲜血琼脂平板上涂板，37℃恒温培养。取现象最明显的一板作为实验结果。

1.2.3 药敏实验

取HPS的TSB液体培养基100μL至于TSA固体培养基上进行涂板，分别涂板9块并贴上强力霉素，林可霉素，复方新诺明，头孢噻肟，新霉素，氨苄西林，青霉素，恩诺沙星，氟苯尼考9种抗菌药物药敏纸片。

2 结果

2.1 生化实验结果

经过24～48h的37℃恒温培养后可知副猪嗜血杆菌能分解葡萄糖、蔗糖、果糖产酸，与氧化酶、过氧化氢酶发生反应为阳性，而其不分解麦芽糖、β-半乳糖苷、尿素、蛋白胨水为阴性。详细结果见表1。

表1 生化实验结果

2.2 卫星生长现象结果

涂板了副猪嗜血杆菌和金黄色葡萄球菌鲜血琼脂平板在37℃恒温培养12h后开始长出金黄色葡萄球菌，然而并未长出副猪嗜血杆菌，直到培养96h后才在金黄色葡萄球菌周围长出肉眼模糊可见的副猪嗜血杆菌，继续培养24h才能看见针尖大小副猪嗜血杆菌。

2.3 药敏试验结果

副猪嗜血杆菌在TSA上涂板并贴上抗菌药物药敏纸片37℃恒温培养48h后，可知大多数抗菌药物都对其有作用，其中头孢噻肟最好，复方新诺明最差，结果见表2。

表2 药敏实验结果

3 分析与讨论

目前，副猪嗜血杆菌已成为猪场常发病，且大多数为混合感染，比较简易的鉴别方法主要是染色镜检、卫星生长现象和药敏实验。生化鉴定仅具有参考价值，主要由于其数据不稳定，这个原因可能来自于试剂生产者或配制者的不同。染色镜检是最常规且最便捷的，主要是由于副猪嗜血杆菌的染色形态及效果和其他细菌是有明显区别的，副猪嗜血杆菌作为一种革兰氏阴性杆菌较其他细菌染色之后颜色较浅，且会出现不同的形态特征，如1日龄副猪嗜血杆菌多数成短杆状，2日龄就会出现长丝状菌且染色效果变差，3日龄基本为长丝状且染色效果较2日龄更差。卫星生长现象也是鉴别副猪嗜血杆菌的常用手段，以副猪嗜血杆菌涂板，金黄色葡萄球菌划线的方法最好，但金黄色葡萄球菌生长速度是远远快于副猪嗜血杆菌，这是由于鲜血琼脂平板中NAD浓度不够需要在金黄色葡萄球菌溶血后补充其浓度。药敏实验也可以作为其一种鉴定方法，主要由于副猪嗜血杆菌对头抱类药物敏感，对复方磺胺类药物、大环内酯类抗生素及氯霉素敏感性不敏感，而且大多数常见抗菌药物对其都有效果，做药敏实验时药敏片多于2个就会出现副猪嗜血杆菌不生长或只在远离药敏纸片的地方出现副猪嗜血杆菌。虽然副猪嗜血杆菌对抗菌药物敏感但治疗效果并不是非常理想，其主要的防治方法还是提高猪体免疫力，包括副猪嗜血杆菌的免疫接种[4]和防止猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和圆环2型病毒(PCV-2)等免疫抑制性疾病。

[1]高鹏程，储岳峰，逯忠新，等.副猪嗜血杆菌病原的分离鉴定与药敏实验[J].动物医学进展,2007,28(12):27-29.

[2]蔡旭旺. 副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究[D].武汉:华中农业大学,2006.

[3]陈勇,高艳,杨增歧.副猪嗜血杆菌的分离鉴定与培养基筛选.动物医学进展[J].2013,34 (10) : 67-71.

[4]宋凤香,陆桂英,肖丽辉,等.副猪嗜血杆菌灭活疫苗对仔猪免疫保护效力的研究[J].山东畜牧兽医,2010,31(6):8-9.