刘泰，黄德庆，张元侃，李丹，黄树武，谭璐璐，刘永辉，李生，姚平，宋曦，何乾超

(广西中医药大学第一附属医院脑病科，南宁 530023)

疏血通脉胶囊对脑缺血-再灌注大鼠p38MAPK的影响*

刘泰，黄德庆，张元侃，李丹，黄树武，谭璐璐，刘永辉，李生，姚平，宋曦，何乾超

(广西中医药大学第一附属医院脑病科，南宁 530023)

目的 研究疏血通脉胶囊预处理对大脑中动脉闭塞再灌注大鼠脑保护作用及对脑内p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)表达的影响。方法 将96只雄性SD大鼠随机分为4组，每组24只，每组按照再灌注后3，6，24，72 h随机分为4个亚组，每个亚组6只。假手术组只分离动脉不插线。缺血-再灌注组建成大脑中动脉闭塞再灌注(MCAO)模型。预缺血组脑缺血预处理，24 h后建立MCAO模型；疏血通脉组先给予疏血通脉胶囊14 d，再制备MCAO模型。Zea Longa 法进行神经功能缺损评分，免疫印迹法检测p38MAPK、P-p38MAPK表达，Tunel法检测神经元凋亡数量，观察p38MAPK、P-p38MAPK表达水平与神经元凋亡相关性。结果 假手术组各时间点均未出现神经功能缺损，其余各组大鼠各时间点均出现不同程度神经功能缺损，并均于24 h达高峰。与缺血-再灌注组比较，预缺血组和疏血通脉组各时间点神经功能缺损情况较轻(P<0.05)。预缺血组与疏血通脉组各时间点神经功能缺损情况相当。假手术组不同时间点P-p38MAPK/p38MAPK比值未见明显变化；其他3组P-p38MAPK/p38MAPK比值增大，且随再灌注时间延长，该比值逐渐升高，24 h达到高峰。预缺血组和疏血通脉组从3 h起，P-p38MAPK/p38MAPK比值减小，并随再灌注时间延长逐渐下降，24 h最低，与缺血-再灌注组比较，均差异有统计学意义(P<0.05)。预缺血组与疏血通脉组不同时间点磷酸化水平相当。假手术组各时间点偶见极少量凋亡神经元，其他各组随再灌注时间延长，神经元凋亡数量逐渐增加, 并于24 h达到高峰。预缺血组和疏血通脉组不同时间点神经元凋亡数量均较缺血-再灌注组少(P<0.05)。结论 疏血通脉胶囊预处理可诱导大鼠脑缺血耐受，减少脑缺血-再灌注后神经元凋亡，改善神经功能，其机制可能与抑制p38MAPK磷酸化有关。

疏血通脉胶囊；预处理，脑缺血；缺血-再灌注，脑；p38丝裂原激活蛋白激酶

在机体接受致死性缺血刺激前给予多种非致死性刺激，可以使机体产生对缺血的保护作用。其中，提前进行的非致死性刺激称为预处理，预处理后产生的对缺血的保护作用称为缺血预适应[1]。以预处理为手段，研究脑缺血预适应产生的机制，可为临床缺血性脑血管疾病提供新的防治策略。缺血预处理对机体是一种创伤，难以在临床中应用。药物预处理由于其可操作性强，成为近年来神经系统药理性预适应研究的热点。预处理可激活多种内源性信号，诱导缺血耐受[2]，从而提高组织对后续较严重缺血的适应能力，降低损伤程度。P38丝裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)作为众多信号转导通路的中转站，近来研究发现其参与了脑缺血耐受的发生发展过程，但所起作用仍受争议。疏血通脉胶囊的组方是广西中医药大学第一附属医院的经验方，前期研究发现其可改善脑血流，减轻神经元损伤，促进神经功能恢复， 在治疗缺血性卒中方面有一定疗效[3-5]。这些脑保护作用能否通过预处理手段诱导产生脑缺血耐受或提高脑缺血预适应能力尚未可知。笔者在本实验中以p38MAPK为切入点，探讨疏血通脉胶囊预处理所诱导的内源性神经元保护机制及作用靶点，以期为研发防治缺血性脑血管病药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级健康成年雄性斯泼累格·多雷(Sprague-Dawley,SD)大鼠96只，购自广西医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号：SCXK桂2009-0002，合格证号：0006909，体质量220～250 g，饲养于广西中医药大学第一附属医院实验室。动物实验室温度：22～25 ℃，相对湿度：55%～70%。大鼠给予普通饲料，自由进食饮水，黑暗与光照时间比为12 h：12 h。

1.2 抗体和试剂 p38MAPK抗体，批号：AF4656；磷酸化p38MAPK抗体(P-p38MAPK磷酸化位点：pTyr180/Thr182)，批号：AF4001。均购自美国Affinity公司；蛋白酶K购自美国Sigma公司。批号：P6556；Tunel凋亡试剂盒(In Situ Cell Death Detection Kit，POD)购自德国Roche公司，批号：11684 817910；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜购自Millipore公司，批号：11981123；辣根过氧化物酶标记山羊抗大鼠，批号：A0208；聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒，批号：P0010S；聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒，批号：P0012A。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组与模型的建立 将大鼠编号，按照计算机产生的随机序列分为4组，每组24只：①假手术组，只分离动脉不插线；②缺血-再灌注组，参照改良Longa法[6]建立大脑中动脉闭塞再灌注(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型；③预缺血组，预缺血3 min、再灌注24 h后采用相同方法造成MCAO；④疏血通脉组，具体方法同缺血-再灌注组。各组单笼喂养，自由进食、饮水，术中死亡大鼠及时补充。造模前，疏血通脉组参照《现代医学实验动物学》[7]，以纯化水为溶媒，将疏血通脉胶囊内容物制成等体积混悬液，按每次380 mg·kg-1灌胃，其余3组灌胃给予等量纯化水，灌胃时间均为14 d。

1.3.2 取材及组织处理 各组大鼠手术清醒后，按Zea Longa 5分制标准[6]进行评分。0分：正常，无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向外侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。然后每组按再灌注后3，6，24，72 h不同时间点分成4个亚组，每亚组6只大鼠，断头处死，剥离大脑梗死区皮质，一部分迅速放入-80 ℃冰箱保存，测定p38MAPK、P-p38MAPK蛋白表达水平。另一部分置于4%甲醛溶液固定保存，制作石蜡切片，Tunel法检测神经元凋亡情况。

1.3.3 免疫印迹法检测p38MAPK、P-p38MAPK表达水平 取大鼠梗死区皮质组织，研磨棒下进行组织研磨，同时加入适量蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，低温高速离心后吸取上清液，即得胞质蛋白成分。BCA法蛋白定量[8]，-20 ℃冰箱保存备用。取蛋白样品，加入上样缓冲液，100 ℃加热变性5 min，以7 720 r·min-1(r=3 cm)离心30 s。分别取各组蛋白样品20 μL进行SDS-PAGE电泳和转膜(使用PVDF膜，100 V电压进行50 min)。取出PVDF膜，三乙醇胺缓冲盐水溶液(tris buffered saline，TBS)洗涤5 min，加入封闭液常温封闭1 h，封闭后加一抗4 ℃孵育过夜，次日TBST(TBS加入聚山梨酯)洗膜3次，加二抗，37 ℃孵育1 h。TBST洗涤3次共10 min，发光反应1 min，压片、显影、定影，扫描条带并分析结果。检测内参时同样按上述方法进行。以P-p38MAPK与p38MAPK的比值(P-p38MAPK/p38MAPK)表示p38MAPK磷酸化水平。

1.3.4 Tunel法检测神经元凋亡 将石蜡切片先后置二甲苯及无水乙醇中室温浸泡，各2次，每次5 min；进行梯度洗脱及磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution，PBS)室温浸洗。4%多聚甲醛室温固定15 min。PBS室温浸洗5 min，共2次。甩去多余液体，抗原微波热修复：将组织切片放入0.01 mol·L-1枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)，在微波炉里加热5 min至沸腾，断电，室温冷却后PBS洗3次，每次3 min。加Tunel反应混合液。盖上覆膜，37 ℃1 h。移去覆膜，PBS室温浸洗5 min，共3次。加Converter-POD反应液，盖上覆膜，37 ℃30 min。移去覆膜，PBS室温浸洗5 min，共3次。加二氨基苯联胺(diaminobenzidine，DBA)显色液100 μL室温反应约10 min。用去离子水冲洗后脱水，透明封片，400倍光镜镜检。

1.4 统计学方法 使用SPSS 17.0版软件进行统计分析，多组间均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐则行LSD(L)检验，方差不齐则取Tamhane’s T2检验结果。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分 假手术组大鼠各时间点活动均正常，评分均为0分。缺血-再灌注组各时间点神经功能评分明显高于预缺血组和疏血通脉组，且24 h为高峰(表1)，差异有统计学意义(P<0.01)。预缺血组与疏血通脉组各时间点神经功能评分差异无统计学意义。

2.2 免疫印迹法检测P-p38MAPK/p38MAPK结果 各组各时间点P-p38MAPK/p38MAPK表达水平见图1。one-way ANOVA检验提示，各组均数不全相同(3，6，24，72 h时间点的组间F值分别为232.96，681.02，1550.32，961.85)。缺血-再灌注组从3 h时即出现p38MAPK信号通路明显激活(表现为P- p38MAPK表达水平上调，P-p38MAPK/p38MAPK比值增大)，并逐渐升高，于24 h达到高峰(图1)；而预缺血组和疏血通脉组从3 h即出现p38MAPK信号通路明显受抑制现象(表现为P-p38MAPK表达水平下调，P-p38MAPK/p38MAPK比值减小)，并逐渐下降，于24 h达最低点。各时间点与假手术组比较，均差异有统计学意义(P<0.05)。预缺血组、疏血通脉组各时间点磷酸化水平均低于缺血-再灌注组，均差异有统计学意义(P<0.05)。各时间点预缺血组与疏血通脉组比较差异无统计学意义。

2.3 神经元凋亡情况 各时间点随机视野观察中，假手术组偶见极少量凋亡细胞。缺血-再灌注组、预缺血组及疏血通脉组随着脑缺血-再灌注时间延长，细胞凋亡数量逐渐增加，并于24 h达高峰(图2)。预缺血组与疏血通脉组各时间点细胞凋亡数量均较缺血-再灌注组少，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

3 讨论

缺血性脑血管病属于中医学中风病范畴。研究提示，中药复方制剂对本病有较好疗效[8-9]。刘泰教授根据中风“本虚标实，痰瘀互结”的辨证特点，总结自己20多年来治疗中风病的经验，立足中风“痰瘀致病”理论[8]，拟三七、胆南星、地龙、石菖蒲、冰片等药物自创醒脑通脉方，前期研究均提示该方有较好的脑保护作用[3-5]。随着研究的深入，刘泰教授保留了化痰祛瘀的理念，在原方基础上去掉胆南星、石菖蒲两味具有微毒的中药，换之以通阳散结、行气导滞的薤白和清热化痰、利气散结的瓜蒌皮，进一步优化成疏血通脉胶囊处方，不但加强了治疗效果，而且保证了用药安全。方中三七、薤白为君药，化痰祛瘀通络；地龙、瓜蒌皮为臣药，协同君药，加强活血祛痰作用；冰片为佐使药，开窍醒神、清热止痛。全方共奏化痰熄风，祛瘀通络，痰瘀同治，疏血通脉之功。本方所用药物经现代药理研究证实，均具有良好的改善脑循环、抗神经细胞凋亡、保护血管内皮细胞及减轻炎症反应等作用[9-12]。本研究结果提示，在大鼠脑缺血前预先给予疏血通脉胶囊灌胃，能够明显减少大鼠脑缺血-再灌注损伤后神经元凋亡的数量，减轻神经功能缺损症状。细胞死亡的形式包括坏死、凋亡、自噬等，其中凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号、环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答有序变化的死亡过程，是细胞死亡的主要形式之一。本研究中细胞凋亡的数量与神经功能损伤程度呈正相关，提示减少神经元凋亡数量可以起到脑保护作用。同时，免疫印迹检测结果提示，疏血通脉胶囊预处理能够显著下调P-p38MAPK的表达水平，提示疏血通脉胶囊预处理可能通过抑制p38MAPK的磷酸化诱导脑缺血耐受的发生，起到了脑保护作用。此外，笔者还观察到各时间点疏血通脉组神经功能缺失、神经元凋亡均轻于预缺血组，且P-p38MAPK活化程度均低于预缺血组，提示疏血通脉胶囊的脑保护作用可能还与其他环节有关。

表1 4组大鼠脑缺血-再灌注后不同时间亚组神经功能缺损评分和神经无调亡情况比较

Tab.1 Comparison of neurologic impairment score and neuronal apoptosis among different time point subgroups of four groups of rats

n=6

与缺血-再灌注组同时间亚组比较，均P<0.01

Compared with the same time subgroup of ischemia/reperfusion group，averageP<0.01

A.假手术组；B.缺血-再灌注组；C.预缺血组；D.疏血通脉组；β-Tubulin为内参

A.sham operation group；B.ischemia/reperfusion group；C.ischemia preconditioning group；D.Shuxuetongmaigroup；β-Tubolin as internal reference

Fig.1 P-p38MAPK/p38MAPK in infarction area in four groups of rats at each time point after reperfusion(n=6)

A.假手术组；B.缺血-再灌注组；C.预缺血组；D.疏血通脉组

A.sham operated group；B.inchemia/reperfusion group；C.ischemia preconditioning group；D.Shuxuetongmaigroup

Fig.2 Neuronal apoptosis in four groups of rats at 24 h(×400)

p38MAPK是家族成员， 主要分布在细胞质区，一旦被激活迅速转位入核，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种功能。目前， 已有大量文献报道p38MAPK在脑缺血耐受中发挥重要作用，但结果并不一致。LI等[13]研究发现P-p38MAPK通过Bcl-xL途径减少神经细胞凋亡。而YAMASHITA等[14]的研究则表明抑制p38MAPK的活化起到脑保护作用。本研究发现，脑缺血预处理可明显减少大鼠脑缺血-再灌注后梗死区皮质神经元凋亡数量，改善神经功能，有明确的脑保护效应；预缺血组大鼠p38MAPK信号通路被抑制，表现为P-p38MAPK/p38MAPK比值显著下降，并于24 h时降到最低水平，这与文献报道一致。本研究结果提示，p38MAPK信号通路的激活可导致神经细胞凋亡，脑缺血耐受的产生与抑制p38MAPK的活化有关。

总之，疏血通脉胶囊预处理通过抑制p38MAPK的磷酸化，起到诱导脑缺血耐受、发挥脑保护作用。这为药物预处理诱导脑缺血耐受产生或提高脑缺血预适应能力提供了实验基础，为缺血性脑血管病的临床有效防治提供了科学依据。疏血通脉胶囊预处理是否存在量效关系、脑损伤前何时给药或脑缺血后继续给药能否进一步提高其防治脑卒中的作用仍待进一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2015.07.002

Effects ofShuxuetongmaiCapsule on Expression of p38MAPK in Rats with CerebralIschemia/Reperfusion

LIU Tai，HUANG Deqing，ZHANG Yuankan，LI Dan，HUANG Shuwu，TAN Lulu，LIU Yonghui， LI Sheng，YAO Ping，SONG Xi，HE Qianchao

(DepartmentofEncephalopathy,theFirstAffiliatedHospital,GuangxiUniversityofTCM，Nanning530023,China)

Objective To explore the neuroprotection ofShuxuetongmaicapsule pretreatment，and the effect on the expression of p38 mitogen-activated protein kinase (p38MAPK) in rats with middle cerebral artery occlusion. Methods Ninety-six male SD rats were divided randomly into sham-operated group，ischemia/reperfusion group (I/R)，ischemia preconditioning group (IP)，andShuxuetongmaigroup(n=24).Each group was further randomly divided into 4 subgroups by 3 h, 6 h, 24 h and 72 h after reperfusion, 6 rats in each subgroup.Sham-operated group was only performed artery separation .The middle cerebral artery occlusion(MCAO) model was set up in I/R rats by Longa method.The IP rats were performed for three minutes on the bilateral carotid artery ligation, and formed MCAO model 24 hours later.The rats in theShuxuetongmaigroup were pretreated withShuxuetongmaicapsules for 14 days on gavage before the establishment of MCAO model.The neurological deficits were graded in rats by Zea Longa method.Western Blot was used to determine the protein expression of p38MAPK and P-p38MAPK.Tunel method was applied to detect the apoptosis of neurons and the relationship between expression of p38MAPK, P-p38MAPK and apoptosis of neuron. Results No neurological dysfunction appeared in the sham-operated group at each time points, but not for the other groups, which reached the peak at 24 h.Compared with the I/R group, IP group andShuxuetongmaigroup presented the mild neurologic function deficiency at different time points in rats (P<0.05), and no significant differences occurred between ischemia preconditioning group andShuxuetongmaigroup (P>0.05).The obvious variation of the value of P-p38MAPK/p38MAPK wasn't detected in sham-operated group at different time points, while obviously presented in I/R group, and the ratios of P-p38MAPK/p38MAPK were increased gradually followed with reperfusion, approaching to the highest level at 24 h.Compared with the I/R group, the P-p38MAPK/p38MAPK declined from 3 h and to the lowest level at 24 h of reperfusion, in both IP andShuxuetongmaigroups(P<0.05), and with similar phosphorylation.At different time points，very few neurons apoptosis were detected in sham-operated groups, but which increased gradually after reperfusion in other groups, and reached to the peak at 24 h.The neurons apoptosis in both IP group andShuxuetongmaigroup were less than that in IR group (P<0.05) at different time points, and it showed no significant differences on neurons apoptosis between ischemia/preconditioning group andShuxuetongmaigroup in rats (P>0.05). ConclusionShuxuetongmaicapsule pretreatment can induce brain ischemic tolerance，attenuate the apoptosis of neurons in cerebral ischemia reperfusion，and improve neurologic function.The mechanism may be related to the inhibition of p38MAPK phosphorylation.

Shuxuetongmaicapsule；Preconditioning, cerebral ischemic; Ischemia/reperfusion, cerebral；p38 mitogen-activated protein kinase

2014-07-12

2014-08-20

*广西自然科学基金资助项目(2011GXNSFA018180)；广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻11107009-1-11)

刘泰(1959-)，男，广西桂林人，主任医师，教授，学士，研究方向：脑血管疾病的中西医结合临床、科研和教学。电话：0771-5848502，E-mail：liutai590216@163.com。

何乾超(1976-)，男，副主任医师，硕士，研究方向：脑血管疾病的中西医结合临床、科研和教学工作。电话：0771-5848502，E-mail：liutai590216@163.com。

R286；R965

A

1004-0781(2015)07-0851-05