陈 艳，高利媛，马 腾，高文娜，贺 佳，刘兴亮，郭 巍，边 勇

(1.北京农学院，北京 102206； 2.北京出入境检验检疫局，北京 100026)

动物生产层

高羊茅根际一种短体线虫的分离与鉴定

陈 艳1，高利媛1，马 腾2，高文娜2，贺 佳1，刘兴亮2，郭 巍1，边 勇2

(1.北京农学院，北京 102206； 2.北京出入境检验检疫局，北京 100026)

高羊茅(Festucaelata)是草坪草中绿期最长的一个草种，在草坪建植中具有重要作用。一些病害随着高羊茅种植范围的不断扩大而逐渐频发，对草坪造成极大经济损失。本研究通过调查北京市高丽营镇高羊茅斑块状枯死的原因发现，导致高羊茅枯死的是高羊茅根际优势植物寄生线虫。采用贝尔曼漏斗法分离了侵染北京地区高羊茅上的线虫，结合唇环、受精囊、食道、V值等形态学鉴定方法，证明高羊茅草根际优势植物的寄生线虫均为一种短体线虫，确定为斯克里步纳短体线虫(Pratylenchusscribneri)。线虫ITS和28S序列的PCR扩增及GenBank序列比对后发现，其与国外发现的P.agilis及P.scribneri序列相似度为93%，亦确证该线虫为斯克里步纳短体线虫。

高羊茅；斯克里步纳短体线虫；分离鉴定

目前草坪在城市的绿化事业进程中发挥着净化空气、优化环境和提供优质运动场所等重要作用，因此，草坪渐渐成为现代生活中不可或缺的部分[1]。我国的草坪业亦呈现出迅速发展的趋势，对草坪草的需求量越来越大。高羊茅(Festucaelata)作为常见的草坪草中绿色周期最长的一个冷季型草种，目前已成为我国首选草坪草植物。然而，随着高羊茅草坪草种植规模的不断扩大，各种病虫害逐渐突出，导致高羊茅草坪外观质量下降，成为制约这一产业发展的限制因素之一[2]。

在我国，关于草坪草病害的报道主要集中在褐斑病、锈病等真菌病害，而关于植物寄生线虫危害草坪草的研究相对较少。在美国等一些草业较为发达的国家，植物寄生线虫一直都是十分重要的草坪草病害之一，美国草坪草的常见致病线虫主要有拟毛刺线虫属(Paratrichodorus)、剑线虫属(Xiphinema)、长针线虫属(Longidorus)、胞囊线虫属(Heterodera)、根结线虫属(Meloidegyne)、假根结线虫属(Hypasoperine)、环纹线虫属(Macropasthonia)、针线虫属(Paratylenchus)、根腐线虫属(Proatylenchus)、刺线虫属(Belonolaimus)、锥线虫属(Dolichorus)、矮化线虫属(Tylenchorhynochus)、螺旋属(Helicotylenchus)和枪线虫属(Hoploaimus)等[3]。目前，国内已报道的危害草坪草根际的短体线虫主要包括矮化线虫属、小环线虫属(Criconemella)、短体属(Pratylenchus)、螺旋属和毛刺属(Trichodorus)内的线虫[4]等。国内危害草坪草的线虫研究工作仍不深入，但植物根际线虫的危害不可小觑，其主要是在植物根部取食，给植物造成伤口从而引起细菌、真菌病害的传播，引起植物的枯黄、腐烂等症状[5-6]。

为了鉴定引起高羊茅斑块状枯死的原因，本研究调查北京市高丽营镇种植高羊茅的土壤，对高羊茅根际优势植物寄生线虫进行分离；并进一步通过形态学结合分子生物学方法对该线虫进行鉴定，以期明确该线虫的种类，为进一步防治该病害提供基础。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

样品土壤采集于北京市顺义市高丽营镇草地，时间为2014年6月；采集选取长势较弱，出现斑点枯萎的高羊茅草坪草，收集其根际土及草根；采样点面积约1万m2，采取“Z”字形多点取样法，收集距地表15 cm左右深度的土样；每个样品(土壤+草根)鲜重袋为1 kg，含有20个采样点混合均匀的土样，每个采样点50 g土样。

1.2 线虫的分离

土壤线虫的分离采用贝尔曼漏斗法分离[7]，即取直径约20 cm的连接一段乳胶管的漏斗，用止水夹控制胶管关闭；漏斗内先注入2/3的清水后，取高羊茅根际土样200 g，用两层纱布包住土样并轻放于漏斗中，使水漫过，浸透；待24 h后，取洁净的玻璃器皿收集10 mL分离获得的线虫悬浮液。

1.3 线虫形态学鉴定

在显微镜下挑出形态大小一致的线虫置于滴有少许蒸馏水的载玻片上，用酒精灯加热2～3 s杀死线虫；然后将线虫依次用挑针排列整齐，盖上盖玻片，用指甲油封片[8]。于光学显微镜下对线虫形态及其内部特征观察、测量和拍照。最后，从中随机选取10条成虫，用Deman公式[8]对挑取的被测成虫进行形态测计。

1.4 线虫的分子鉴定

1.4.1 单条线虫DNA的提取 根据王江岭等[9]的方法，取200 μL的PCR管，内置5 μL 10× PCR buffer与10 μL超纯水，并将经过dd H2O反复漂洗的线虫挑入PCR管中。先将PCR管置于离心机中离心120 s，然后液氮冷冻PCR管底2～3 min、85 ℃加热2.5 min后，向管中加入1 μL的蛋白酶K，将PCR管置入PCR仪中56 ℃、30 min，95 ℃、10 min；最后将PCR管置于离心机12 000 r·min-1离心120 s，离心过后取上清液直接用于PCR扩增。

1.4.2 PCR扩增 线虫DNA的PCR扩增方法见De Luca和Reyes[10]的报道。反应在mastercycler(Eppendorf)上进行,ITS区序列扩增反应体系(50 μL)：10×PCR buffer 5 μL，10 mmol·L-1dNTP 1 μL，10 μmol·L-1的上/下游引物各3 μL，5 U· μL-1Taq DNA聚合酶0.6 μL，线虫粗提液5 μL ，加纯净水定容至50 μL。

ITS区序列上游引物为ITS1：5’-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3’，下游引物为ITS2：5’-GCTGCGTTCTTCATCGAT-3’[11-12]；反应条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，36个循环；72 ℃，8 min。

28S rDNA D2D3区序列上游引物为D2A：5’-ACAAGTACCGTCAGGGAAAGTGG-3’，下游引物为D3B：5’-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3’[13]；反应条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，37个循环；72 ℃，8 min。

PCR结束后，取5 μL产物于1.2%的琼脂糖凝胶电泳25 min，采用凝胶成像系统成像，观察电泳结果，拍照并记录。挑取阳性条带的产物于北京六合通公司测序。将测序的结果在GenBank中进行同源性比对，并从比对的结果中分别选取同源性较高的18种短体属线虫的rDNA ITS区和15种短体属线虫的D2D3区序列进行系统发育分析，选取Bursaphelenchusxylophilus序列作为外群(Outgroup)对照，并通过软件MEGA4.1，选用临接法(Neighbor-Joining)距离模型进行系统发育树分析，并应用自展法(Bootstrap)检验系统树的可靠性，自展数据集为800次[14]。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

2.1.1 形态学描述 通过在显微镜下观察高羊茅草坪草根际分离的线虫形态发现(图1)，雌虫温热杀死后体略向腹面弯曲；侧区4条侧线，中间宽，两边窄，从口针基球延伸到尾端；唇区较低，唇环两条，基环高于顶环，唇区缢缩明显；头架发达，深度骨化；口针发达，口针基部球圆形，长15～16 μm；中食道球卵圆形，宽约占该处体宽的2/3；食道腺从腹面和侧面覆盖肠的前端；阴门偏前，V值为77%～79%；排泄孔在食道一肠瓣门的前方；后尾端光滑无纹，尾环数为18～19。未发现雄虫。

图1 草坪草根际短体线虫形态图Fig.1 Morphological photographs of Pratylenchus from turfgrass

注:A，阴门；B，头部；C，尾部；D，雌虫成虫；E，食道。

Note: A, vulva； B, stylet； C, tail; D, femail adult; E, oesophagus.

2.1.2 形态测计值 从北京市顺义区高羊茅草坪草根际分离的短体线虫，形态特征和测计值与Loof[15]和Hashim[16]等的描述最为接近(表1)。故初步将其鉴定为斯克里步纳短体线虫Pratylenchusscribneri。

2.2 分子生物学特征

2.2.1 rDNA ITS区序列特征 分别将3条线虫的PCR产物进行测序[17]。除去两端18S和28S序列后，得到片段大小约为750 bp的3条序列[17]。将3条序列与NCBI 数据库中的序列比对后发现，这3条线虫的ITS区序列与Pratylenchusagilis(编号为JQ039330)及P.scribneri(编号为JX04693)序列相似度为93%(目前业内已经认同P.agilis与P.scribneri为同一种类的同物异名[18])，本研究将这两种按同一种类处理)。系统发育分析也可以看出(图2)，本研究发现的短体线虫种类与P.scribneri聚为一组。

2.2.2 D2D3区序列特征 分别将4条线虫的PCR产物进行测序，得到D2D3区序列片段长度约为760 bp的4条序列，通过NCBI比对，与编号为JX047002、Eu130865、AF170444、DQ498832的P.scribneri序列相似度为97%～99%；系统发育分析与ITS 区分析结果基本一致，4条序列都聚在P.scribneri组群中，与其他种短体线虫差异明显(图3)。

表1 Pratylenchus北京群体与已报道种群测计值比较

注：n为数量;L为体长(mm)；a为体长/最大体宽；b为体长/体前端至食道与肠连接处的距离；b’为体前端至食道腺末端的距离；c为体长/尾长；c’ 为体长/肛门处体宽；V为体前端至阴门的距离×100/体长； St为口针(μm)。

Note: n, number; L, body length(mm); a, body length/maximum body width; b, body length/the distance from body front to esophagus and intestines junction; b’, the distance of body front to the end of the esophagus gland; c, body length/tail length; c’, body length/ anus body width; V, the distance of body front to vulva×100/body length; St, stylet (μm).

图2 基于rDNA ITS 区序列的临接法(NJ)构建系统发育树Fig.2 Phylogenetic relationships tree by Neighbor-Joining (NJ) using ITS rDNA sequences

注：图中1,2,3为本研究基于rDNA ITS 区序列所获得的线虫序列编号。

Note: The 1,2,3 sequence number of nematode were obtained by using ITS rDNA sequences in the research.

图3 基于rDNA D2D3区序列的临接法(NJ)构建系统发育树Fig.3 Phylogenetic relationships tree by Neighbor-Joining (NJ) using D2D3 rDNA sequences

注：图中1,2,3,4为本研究基于rDNA D2D3区序列所获得的线虫序列编号。

Note: The 1, 2, 3, 4 sequence number of nematode were obtained by using D2D3 rDNA in the research.

通过Blast和系统进化分析，进一步验证了形态学鉴定的结果，该线虫为斯克里步纳短体线虫P.scribneri。

3 讨论与结论

近几年来，全国对生态保护、环境建设和城市绿化美化的关注持续增加。而作为重要物质基础的牧草和草坪草种子，其需求量逐年增加。植物寄生线虫作为植物主要病原物之一，其对植物的危害程度超过细菌和病毒，仅次于真菌病害。据统计，植物线虫病每年约造成1 000亿美元的损失，损失率高达12.3%[19]。植物寄生线虫不仅对寄生植物造成直接危害，而且也可直接传播细菌和病毒，对农林业的生产造成巨大危害，成为制约农林业发展的主要因素。我国目前对于草坪草的植物线虫病害的研究仍不够深入，包括对草坪中的植物线虫的种类鉴定，而植物病原线虫的准确鉴定是植物病害高效治理的前提。相比之下，国外针对植物线虫的病害研究相对深入，早在19世纪初就将植物线虫病害作为主要的植物病害之一[8]，并通过对草坪线虫的种类鉴定来达到草坪病害的预防和防治的目的。本研究在北京市顺义区高羊茅首次发现了斯克里步纳短体线虫P.scribneri，可以为今后的线虫防治工作提供可靠的理论依据。

斯克里步纳短体线虫P.scribneri属短体线虫属中分布相对广泛的种类之一。该属线虫主要危害植物根系部位，在植物根系部位取食，并通过伤口引起其他真菌、细菌病害的复合侵染，严重时会引起根系的腐烂，导致植物死亡。该属线虫寄主范围广，而且世代短、繁殖快，不易被识别，该线虫造成的危害不可小觑。Loof[15]、Thorne和Malek[20]、Loof[21-22]、高学彪等[23-24]、段玉玺等[25]先后对其进行过描述。已有的报道表明，该线虫在我国的寄主主要为大豆(Glycinemax)、马铃薯(Solanumtuberosum)、高粱(Sorghumvulgare)、小米(Panicummiliaceum)、小麦(Triticumaestivum)、番茄(Solanumlycopersicum)和油菜(Brassicacampestris)等[11]，但寄生在草坪草根部的斯克里步纳短体线虫目前尚无报道。

本研究从高羊茅草坪草根际分离得到的短体线虫种群，其形态及测计值与斯克里步纳短体线虫最为接近，其D2D3区序列比对显示与GenBank中已登记的多条Pratylenchusscribneri序列相似度为97%～99%，系统进化距离较近，显示其为斯克里步纳短体线虫，但与此同时，ITS区序列比对结果显示其与已登记的P.scribneri种类也存在一定的差异，这可能属于地理种群或不同寄主生境下的种群变异，笔者将针对此做后续研究。

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(责任编辑 武艳培)

Identification and separation ofPratylenchusfrom root ofFestucaelata

CHEN Yan1, GAO Li-yuan1, MA Teng2, GAO Wen-na2, HE Jia1, LIU Xing-liang2, GUO Wei1, BIAN Yong2

(1.Beijing university of Agriculture, Beijing 102206, China； 2.Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Beijing 100026, China)

Festucaelatais one of turfgrass species with longer green period and is very important in the construction of ecological environment. However, some diseases frequently occur and bring heavy economical loss to the lawn with the extended of tall fescue growing regions. In the present paper, an investigation about the reasons of dead patches in tall fescue lawn in Beijing's Gaoliying Town suggested that the predominant parasitic nematodes of tall fescue's rhizosphere were the primary cause of mortality. The parasitic nematodes isolated from tall fescue using the Behrman funnel method were short body nematodes with over 100 per 100 mL soil samples of population density. The parasitic nematodes were further identified asPratylenchusscribneribased on morphology characteristics including esophagus, lip annulus, spermatheca, stylet length and V value. The internal transcribed spacer (ITS) region of rDNA was amplified from genomic DNA and sequenced. The sequence had 93% similarity with the species ofP.agilisandP.scribneriin Genebank which confirmed the nematode wasP.scribneri. To best of our knowledge, this is the first report thatP.scribnericause tall fescue patchy disease in China.

Festucaelata;Pratylenchusscribneri; separation; identification

GUO Wei E-mail:guowei@hebau.edu.cn BIAN Yong E-mail:biany@bjciq.gov.cn

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0447陈艳，高利媛，马腾，高文娜，贺佳，刘兴亮，郭巍，边勇.高羊茅根际一种短体线虫的分离与鉴定[J].草业科学,2015,32(6):988-993.

2014-10-08 接受日期：2015-01-12

国家质检总局科技计划项目“进境牧草种子真菌筛查技术研究初探”(2015IK021)；北京出入境检验检疫局科技计划项目“北京地区进境植物繁殖材料隔离检疫模式适用与推行初探”(2013BK008)；北京市农业技术试验示范项目(20140128)

陈艳(1972-)，女，陕西西安人，讲师，博士，主要从事植物保护研究。E-mail:cheny@bua.edu.cn共同

第一作者：高利媛(1993-)，女，北京人，在读本科生，主要从事植物保护研究。E-mail:708859234@qq.com

郭巍(1971-)，女，黑龙江绥化人，教授，博导,博士，主要从事植物保护研究。E-mail:guowei@hebau.edu.cn边勇(1981-)男，陕西延安人，农艺师，硕士，主要从事植物线虫检疫工作。E-mail：biany@bjciq.gov.cn

S435.4

A

1001-0629(2015)06-0988-06

CHEN Yan,GAO Li-yuan,MA Teng,GAO Wen-na,HE Jia,LIU Xing-liang,GUO Wei,BIAN Yong.Identification and separation ofPratylenchusfrom root ofFestucaelata[J].Pratacultural Science，2015,32(6)：988-993.