徐 博，任 伟，王英哲，孙启忠，郭 玮，娄玉杰

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118； 2.吉林省农业科学院，吉林 公主岭136100；3.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010； 4.吉林省畜牧总站，吉林 长春 130062)

植物生产层

农杆菌介导的朝鲜碱茅PuP5CS基因转化紫花苜蓿的研究

徐 博1，任 伟2，王英哲3，孙启忠3，郭 玮4，娄玉杰1

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118； 2.吉林省农业科学院，吉林 公主岭136100；3.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 010010； 4.吉林省畜牧总站，吉林 长春 130062)

为提高紫花苜蓿(Medicagosativa)的抗逆性，利用在朝鲜碱茅(Puccinelliachinampoensis)已克隆的PuP5CS基因成功构建了pCAMBIA3300-PuP5CS表达载体，以子叶为外植体，通过农杆菌介导共培养法转化紫花苜蓿“公农5号” (M.sativacv.Gongnong No.5)，并以2.0 mg·L-1的草铵膦进行筛选，抗性愈伤组织诱导率为22.4%，经草铵膦筛选的植株进行PCR检测和RT-PCR检测。结果显示，共获得11株转化植株，表明PuP5CS基因已转入T0紫花苜蓿植株，且能够在RNA水平上正常表达。

PuP5CS；紫花苜蓿；遗传转化；农杆菌介导法

目前，土壤的盐渍化已经成为制约牧草生产的环境因子之一，在一定程度上限制了优良牧草品种在我国北方牧草主产区的应用[1]。作为世界上最重要的牧草之一，紫花苜蓿(Medicagosativa)享有“牧草之王”的美誉，具有分布广泛、营养丰富等优点，目前我国也选育出了多个耐盐型紫花苜蓿品种[2-3]。作为我国东北地区的当家苜蓿品种之一，“公农5号”具产量高、抗旱性好等优势，是我国东北地区近年来大量推广种植的苜蓿品种之一。而利用生物技术手段获得转基因育种材料也是育种家在除传统育种方式以外，在新品种选育方面经常利用的一项技术[4]。

△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物脯氨酸合成的关键酶和限速酶，在受到外界胁迫条件下，P5CS基因能够增加细胞质中脯氨酸的合成，从而提高植物的抗逆性，但其合成也受到脯氨酸的反馈抑制[5-7]。近年来，许多学者克隆了P5CS的同源基因并进行了其表达分析研究[8-10]。在NaCl处理条件下，P5CS基因在叶片里的相对表达量都高于对照[11-12]。李志亮等[10]将P5CS基因导入高羊茅(Festucaelata)后，转基因植株的脯氨酸含量比正常植株提高了31%～83%，其抗旱性也高于对照。转P5CS基因的蒙农冰草(Agropyroncristatum)在盐胁迫的条件下，其游离脯氨酸的含量增加较快，耐盐性明显增加[13]。

目前对于紫花苜蓿遗传转化的研究较多，方法上倾向于利用农杆菌介导法进行遗传转化[14]。而为了达到最佳的转化效率，针对不同的受体基因型、不同的植物受体的研究显得尤为重要。本研究的目的基因PuP5CS基因是从朝鲜碱茅(Puccinelliachinampoensis)中克隆得到的，通过构建含目的基因及带bar筛选基因的植物表达载体，以农杆菌介导的方法，将PuP5CS基因整合到紫花苜蓿的基因组中，以期得到转基因植株，为未来检验PuP5CS基因能提高苜蓿抗逆性、进而得到具有更强抗逆性的转基因材料，以及紫花苜蓿的抗逆育种研究提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 紫花苜蓿所用材料为公农5号(M.sativacv. Gongnong No.5)，由吉林省农业科学院草地研究所提供。

1.1.2 菌株和质粒 质粒选用含bar基因的pCAMBIA3300，由吉林省农科院转基因中心提供。大肠杆菌DH5α和农杆菌LBA4404均由吉林农业大学动物科学技术学院实验室保存。

1.1.3 试剂 产品由Takara公司提供，限制性内切酶、RNaseA、Taq酶、dNTP、T4连接酶等由Takara公司提供；反转录酶、琼脂糖凝胶回收试剂盒由OMEGA公司提供，DNA的提取选用OMEGA的E.Z.N.A.®Plant DNA Kit，头孢霉素(Cef)、利福平(Rif)、链霉素(Str)卡那霉素(Km)、草铵膦(glufosinate-ammonium)购自Sigma公司提供，其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计 根据朝鲜碱茅PuP5CS基因的DNA序列，利用DNAMAN软件进行引物设计，引物均由上海生工生物技术有限责任公司合成。

1.2.2 植物表达载体 pCAMBIA3300-PuP5CS的构建 根据PuP5CS基因的序列和选取的酶切位点设计引物，由于选用的酶切位点为XbaI和SacI，引物序列为：PF(5′-TCTAGAATGGCCACCGCGGACC-3′)；PR(5′-GAGCTCTCATTG CAAAGGAAGGTTCTTATG-3′)。采用XbaI和SacI双酶切pMD18-T-PuP5CS和pCAMBIA3300载体，分别回收载体片段，将PuP5CS基因和pCAMBIA3300载体片段用T4 DNA连接酶进行连接，并转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，在LB培养基(含Kan抗性)平板上进行筛选，挑取阳性单菌落进行菌液PCR，经酶切和PCR鉴定，构建植物表达载体。

1.2.3 表达载体pCAMBIA3300-PuP5CS农杆菌转化子的获得 利用冻融法制备农杆菌感受态,并将表达载体pCAMBIA3300-PuP5CS转化农杆菌LBA4404在培养基[YEP+25 mg·L-1Rif+100 mg·L-1Kan]上进行筛选，利用PCR法进行菌落鉴定。

1.2.4 紫花苜蓿的遗传转化和草铵膦抗性筛选 将紫花苜蓿种子先用70%酒精处理2 min，20%次氯酸钠灭菌30 min，无菌水冲洗5次后4 ℃保存一夜，再用20%次氯酸钠灭菌30 min，无菌水冲洗5次后接种到MS培养基上培养无菌苗。以培养7 d无菌苗的子叶为外植体，在活化后的农杆菌(含PuP5CS)菌液中侵染30 min，在愈伤诱导共培养基[UM+2 mg·L-12,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)+0.25 mg·L-1KT(kinetin)]上共培养3 d，移入含草铵膦浓度为0、1、2、3 mg·L-1四个梯度愈伤诱导筛选培养基[UM+2 mg·L-12,4-D+0.25 mg·L-1KT+350 mg·L-1Cef(cefotaxime)]上，每个培养基中摆放20个外植体，共设置5个重复。在培养7 d和20 d时观察愈伤组织生长状态以确定草铵膦的最佳筛选浓度。愈伤诱导20 d后移入含草铵膦的分化筛选培养基[UM+1.2 mg·L-1KT+350 mg·L-1Cef]中，分化培养40 d后移入减半后的含草铵膦生根筛选培养基[1/2 MS+350 mg·L-1Cef]中培养至得到紫花苜蓿抗性转化植株。

1.2.5 抗性转化的分子检测 紫花苜蓿叶片的DNA提取按照OMEGA的Plant DNA Mini Kit说明书进行，RNA提取采用Trizol法，反转录为cDNA后备用。以未经转化的植株作为阴性对照进行PCR检测，体系为25 μL，反应条件同上。根据bar基因的序列设计引物BF(5′-GGTCTAGAATGAGCCCAGAACGACGCC-3′)和BR(5′-CTCGGATCCTCAGATCTCG GTGAC-3′)进行bar基因的PCR检测。RT-PCR检测根据PuP5CS序列用设计好的引物(PF5′-TCTAGAATGGCCACCGCGGACC-3′)和(PR5′-GAGCTCTCATTGCAAAGGAAGGTTCTTATG-3′)进行检测。

2 结果与分析

2.1 植物表达载体pCAMBIA3300-PuP5CS的鉴定

所构建的pCAMBIA3300-PuP5CS载体的图谱见图1，选择了XbaI位点和SacI位点，根据这两个酶切位点的特点，进行双酶切鉴定，得到两个片段，其中2 100 bp左右的片段为PuP5CS，依照电泳的结果(图2)，验证了所构建的pCAMBIA3300-PuP5CS载体是正确的，能够用于后续的紫花苜蓿的遗传转化。

2.2 农杆菌的转化

通过利用冻融法将构建好的植物表达载体pCAMBIA3300-PuP5CS转化农杆菌LBA4404，28 ℃培养48 h后挑取5个单菌落，摇菌后进行PCR鉴定，结果表明，5个单菌落都能够扩增出PuP5CS的特异性片段，约2 100 bp(图3)，说明表达载体pCAMBIA3300-PuP5CS已经成功转化农杆菌LBA4404。

图1 植物表达载体pCAMBIA3300-PuP5CS的酶切位点和图谱Fig.1 Sketch map and restriction sites of pCAMBIA3300-PuP5CS

图2 pCAMBIA3300-PuP5CS重组载体的酶切鉴定Fig.2 Identification of pCAMBIA3300-PuP5CSwith Xba I and Sac I

注：Maker为DNA Marker DL15000 plus；1为质粒pCAMBIA3300-PuP5CS； 2为Xba I和Sac I双酶切质粒。

Note: M, DNA Marker DL15000 plus;1, pCAMBIA3300-PuP5CS; 2, Double-enzyme cleavage with Xba I and Sac I.

图3 pCAMBIA3300-PuP5CS农杆菌转化子的PCR鉴定Fig.3 PCR identification of pCAMBIA3300-PuP5CSagrobacterium independent

2.3 草铵膦选择压的确定

不同草铵膦浓度对愈伤诱导的影响见表1。随着培养时间从7 d增加到20 d，愈伤组织受草铵膦的影响逐渐显现，因此培养20 d的愈伤组织诱导率低于培养7 d的愈伤组织诱导率。在草铵膦浓度达到1.0 mg·L-1时，对于愈伤组织的诱导有一定的影响，在培养20 d后，部分愈伤褐化并最终死亡，最终诱导率为65%。而在草铵膦浓度达到2.0 mg·L-1时，培养7 d时愈伤组织褐化现象就较为明显，且愈伤诱导率显著下降(31%)，而在培养20 d后，只有10个外植体诱导出愈伤而没有褐化。而当草铵膦的浓度增加到3.0 mg·L-1时，培养7 d所有愈伤组织均出现褐化现象，所有的外植体都没能够诱导出愈伤组织就已经死亡。因此选择2.0 mg·L-1草铵膦作为筛选压。

表1 不同草铵膦浓度对愈伤诱导的影响

注：同列不同小写字母表示不同浓度间差异显著(P<0.05)。

Note: Different lower case letters within the same column indicate significant difference among different concentration of glufosinate ammonium at 0.05 level.

2.4 农杆菌转化后抗性愈伤的分化及幼苗的获得

子叶在经农杆菌侵染30 min后，经过3 d的共培养(图4A)，转移至愈伤诱导筛选培养基[UM+2.0 mg·L-12,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid)+0.25 mg·L-1KT(kinetin)+2.0 mg·L-1草铵膦+350 mg·L-1Cef(cefotaxime)]上培养20 d，后移入分化筛选培养基[UM+1.2 mg·L-1KT+2.0 g·L-1草铵膦+350 mg·L-1Cef]培养40 d，非抗性愈伤逐渐褐化并且没有愈伤组织产生，而抗性愈伤组织表面分生出绿色点状组织(图4B)，参试的250个外植体共获得56个抗性愈伤组织，抗性愈伤组织获得率为22.4%，抗性愈伤组织逐渐分化成苗(图4C)，成苗后再转入生根筛选培养基[1/2 MS+1.0 mg·L-1草铵膦+350 mg·L-1Cef ]后生根(图4D)，待根系足够发达后移栽至小盆中，共获得13株抗性苗。

2.5 抗性转化植株的PCR鉴定

将获得的草铵膦抗性植株移栽至花盆中后，共获得的13株存活植株，在其中选取8株，提取DNA，以质粒pCAMBIA3300-PuP5CS为阳性对照，以非转基因植株作为阴性对照，进行PCR扩增。结果显示，部分抗性转化植株能够扩增出2 100 bp左右的特异性条带，在阴性对照泳道上则没有该特异性条带，通过引物BF和BR进行bar基因的检测结果(图6)，可以认为目的基因PuP5CS已经整合到公农5号紫花苜蓿的基因组中(图5)。

图4 公农2号紫花苜蓿的遗传转化Fig.4 Genetic transformation system of Madicago sativa cv. Gongnong No.5

注：A，共培养；B，胚性愈伤；C，分化；D，诱导生根。

Note: A, coculture； B, callus induction； C, regeneration； D, rooting.

图5 转PuP5CS苜蓿的PCR检测Fig.5 The PCR analysis of transgenic plant

注：Maker为DL15000；CK+为质粒DNA；CK-为野生型阴性对照；1,2,3,4,5,6,7,8分别为检测DNA样品。

Note: M, DNA Marker DL15000; CK+, plasmid DNA; CK-, wild type plant;1,2,3,4,5,6,7,8,DNA samples.

图6 转PuP5CS苜蓿的bar基因PCR检测Fig.6 The PCR analysis of transgenic plant

注：Maker为DL2000；CK+为质粒DNA，CK-为野生型阴性对照，1,2,3,4,5,6,7,8分别为检测DNA样品。

Note: M, DNA Marker DL2000; CK+, plasmid DNA; CK-, wild type plant;1,2,3,4,5,6,7,8,DNA samples.

2.6 抗性转化植株

为了在mRNA水平上检测转PuP5CS抗性转化植株的表达情况，选取PCR鉴定为阳性的再生植株，进行RNA的提取，反转录cDNA第一链。以引物BF,BR进行RT-PCR扩增，选择PCR鉴定阳性的植株进行检测，在2 100 bp左右检测到了条带，且与目的片段的大小一致，该基因可以在抗性转化紫花苜蓿植株中转录为mRNA，在RNA水平能够被检测到(图7)，最终共获得11株抗性植株。

图7 转PuP5CS苜蓿的RT-PCR检测Fig.7 The RT-PCR testing of PuP5CS transgenic plant

注：Maker为DL15000；CK+为质粒DNA，CK-为PCR检测阴性植株，1,4,5分别为PCR鉴定阳性植株。

Note: M, DNA Marker DL15000; CK+, plasmid DNA; CK, non-transgenic plant; 2, 4, 5, cDNA of transgenic plants.

3 讨论和结论

3.1 pCAMBIA3300-PuP5CS表达载体的构建

是否能够构建一个含目的基因的高效植物表达载体，是成功进行植物遗传转化的重要前提之一。本研究成功构建了由CaMV35s强启动子调控的脯氨酸合成酶PuP5CS的植物表达载体pCAMBIA3300-PuP5CS，并转入LBA4404农杆菌中，能够为进一步进行紫花苜蓿农杆菌遗传转化打下基础。目前在植物表达载体的构建中，多使用CaMV35s强启动子[15-16]，使外源基因能够在植物的各个部位都能表达，但相对特异性较差，外源基因可能会在植物体内表达出无功能的蛋白质，从而影响正常生理代谢。在下一步的工作中，希望能够构建用于PuP5CS的特异性启动子来替换CaMV35s启动子的植物表达载体，以更有利于获得抗逆性强的紫花苜蓿的遗传转化。

3.2 侵染材料的选择

对于农杆菌侵染的受体，一般选择由外植体诱导产生的愈伤组织，愈伤组织的细胞分裂旺盛，对于外源DNA的转入效果好[17-18]。但在紫花苜蓿的遗传转化中，由于紫花苜蓿外植体诱导出的愈伤组织质地松软，在农杆菌侵染过程中极易碎裂成小块，在后续试验中带来很多困扰的因素，因此大部分学者虽然选择了不同外植体作为侵染材料，而较少使用愈伤组织[19-20]，验证了以外植体为农杆菌侵染的受体也是可行的。而本研究中通过之前研究中得出的结果，选用子叶作为侵染材料，并最终获得了抗性转化植株，因此在以“公农5号”为材料的遗传转化体系中，使用子叶作为外植体是可行的。

3.3 草铵膦对转化效率的影响

由于选用了pCAMBIA3300载体进行双元表达载体的构建，其筛选基因为bar基因。相对于其他载体的筛选基因，其筛选效果较好，在本研究中紫花苜蓿对于草铵膦的敏感程度也很高。在进行的草铵膦选择压的确定时，选择了愈伤诱导阶段能够诱导出愈伤的数量作为判断紫花苜蓿选择压的标准。而在进行农杆菌转化苜蓿的试验中，选择了分化期才加入草铵膦进行筛选，这主要是为了能够得到更多的分化植株，也是为了避免草铵膦对愈伤诱导和生长状态的影响。而在生根期，由于考虑到生根对于筛选压的承受能力较差，过于敏感，适当降低了选择压，使用了1.0 mg·L-1的草铵膦在这一步骤进行筛选。草铵膦在分化初期就能够筛选掉大量的愈伤组织，尽管在试验的过程中，大量侵染后的外植体在诱导分化为植株的过程中被筛选掉，最终得到的植株数量也非常少，但经筛选得到的阳性植株基本都能确定为转基因植株，大大节省了组培过程中的培养基配制等工作，以及植株移栽后的DNA提取、PCR检测等工作所用的时间。在未来大量进行苜蓿遗传转化的过程中，是一种非常有效的筛选基因。

为提高紫花苜蓿的抗逆性，本研究利用已克隆的朝鲜碱茅PuP5CS成功构建了pCAMBIA3300-PuP5CS表达载体，利用农杆菌介导法对紫花苜蓿进行了遗传转化，得到了经草铵膦筛选的抗性植株，目的基因和bar基因的PCR检测和RT-PCR检测结果表明PuP5CS已经成功转入紫花苜蓿的基因组当中，且能够正常表达，共获得11个转基因植株，为紫花苜蓿耐盐新品种的选育奠定了基础。

致谢：该论文是第二届全国草业生物技术大会评选出的优秀论文，并得到中国草业生物技术专业委员会提供的版面费支持。

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(责任编辑 王芳)

Transformation ofPuccinelliachinampoensisPuP5CSgene into alfalfa withAgrobacterium-mediated method

XU Bo1, REN Wei2, WANG Ying-zhe3, SUN Qi-zhong3, GUO Wei4, LOU Yu-jie1

(1.College of animal science and technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2.Jilin Academy of Agricultural Sciences, Gongzhuling 136100, China; 3.Grassland Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences，Huhhot 010010, China; 4.Jilin province animal husbandry, Changchun 130062, China)

In order to cultivate resistance alfalfa (Medicagosativa), the plant expression vector pCAMBIA3300-PuP5CSwas constructed and transformed into alfalfa from cotyledon via agrobacterium mediated. The transformed plants were selected with 2.0 mg·L-1glufosinate ammonium and the ratio of transformation callus differentiation was 22.4%. Eleven transformed plants were identified as positive in the gene expression by PCR and RT-PCR which suggested that thePuP5CSgene had been integrated into the genome of the regenerated plants.

PuP5CSgene; alfalfa; genetic transformation;Agrobacterium-mediated

LOU Yu-jie E-mail：lyjjlau@163.com

10.11829j.issn.1001-0629.2014-0556

2014-12-08 接受日期：2015-03-03

吉林省科技厅青年科研基金(20140520177JH);吉教科合字[2015]第197号

徐博(1983-)，男，吉林公主岭人,讲师，博士，研究方向为牧草种质资源开发与利用、牧草育种。E-mail：xubo0308@126.com

娄玉杰(1956-)，女,吉林省吉林市人,教授，博导，博士,研究方向为牧草饲料资源开发与利用。 E-mail：lyjjlau@163.com

S816;Q943.2

A

1001-0629(2015)06-0895-06

徐博,任伟,王英哲,孙启忠,郭玮,娄玉杰.农杆菌介导的朝鲜碱茅PuP5CS基因转化紫花苜蓿的研究[J].草业科学,2015,32(6):895-901.

XU Bo,REN Wei,WANG Ying-zhe,SUN Qi-zhong,GUO Wei,LOU Yu-jie.Transformation ofPuccinelliachinampoensisPuP5CSgene into alfalfa withAgrobacterium-mediated method[J].Pratacultural Science，2015,32(6)：895-901.