路新卿，杨红，李景南，胡益群，钱家鸣

·论著·

ARHI基因抑制胰腺癌细胞增殖的作用机制研究

路新卿，杨红，李景南，胡益群，钱家鸣

目的观察ARHI基因对胰腺癌细胞增殖的影响，探讨其抑制细胞增殖的机制。方法2009年3—9月人胰腺癌细胞株PANC－1选自北京协和医院，根据转入质粒将培养细胞分为Control组(无转染质粒的PANC－1细胞)、Vector组(稳定表达pIRES2－EGFP质粒的PANC－1细胞)、ARHI组(稳定表达pIRES2－EGFP－ARHI质粒的PANC－1细胞)。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法分析3组胰腺癌细胞在培养第0、1、2、3、4、5天增殖情况;应用流式细胞仪检测3组胰腺癌细胞周期;通过Western blotting法检测3组ARHI、磷酸化丝氨酸蛋白激酶(p－AKT)、MDM2、p53、p21WAF1、丝氨酸蛋白激酶(AKT)表达;应用碘化丙啶(PI)－3K/AKT抑制剂LY294002干预ARHI组，检测ARHI、p－AKT、MDM2、p53、p21WAF1、AKT表达。结果3组培养第1、2、3、4、5天细胞增殖情况比较，差异均有统计学意义(P＜0．05)。Vector组培养第4、5天细胞增殖情况与Control组比较，差异有统计学意义(P＜0．05);ARHI组培养第1、2、3、4、5天细胞增殖情况与Control组和Vector组比较，差异均有统计学意义(P＜0．05)。3组细胞周期比较，差异均有统计学意义(P＜0．05)。Vector组G0－G1期、S期细胞所占比例与Control组比较，差异有统计学意义(P＜0．05);ARHI组G0－G1期、S期细胞所占比例与Control组和Vector组比较，差异有统计学意义(P＜0．05);ARHI组G2－M期细胞所占比例与Control组比较，差异有统计学意义(P＜0．05)。与Control组和Vector组相比，ARHI组p－AKT、MDM2表达降低，p53、p21WAF1表达增多，而AKT表达没有变化;ARHI组加入LY294002与未加入LY294002相比，p－AKT、MDM2表达降低，p53、p21WAF1表达增加，而ARHI、AKT表达没有变化。结论ARHI基因通过抑制PI－3K/AKT/MDM2，导致p53、p21WAF1表达上调，在胰腺癌发生中起着重要的作用。

胰腺肿瘤;细胞增殖;PI－3K/AKT通路;ARHI基因;细胞周期

路新卿，杨红，李景南，等．ARHI基因抑制胰腺癌细胞增殖的作用机制研究［J］．中国全科医学，2015，18 (36):4455－4458．［www．chinagp．net］

Lu XQ，Yang H，Li JN，et al．Mechanism of ARHIgene in inhibiting pancreatic cancer cell proliferation［J］．Chinese General Practice，2015，18(36):4455－4458．

胰腺癌发生率较低，但其病死率很高，胰腺癌占新发癌症的3%，但其引起的病死率占癌症死亡原因的第4位［1］。预期到2030年，其将升至为癌症死亡原因的第2位［2］。由于胰腺癌早期诊断困难，手术治疗后长期生存率低，故降低胰腺癌的病死率，必须做到早期诊断、早期治疗。因此，从基础研究中发现胰腺癌早期诊断的线索是目前研究的方向之一。ARHI基因是一个抑癌基因，属于Ras家族，具有抑制细胞生长、促进细胞凋亡和抑制细胞迁移的作用，在人体很多肿瘤组织低表达或者表达缺失，在肿瘤的发生发展中起着一定作用［3－4］。前期研究表明，ARHI基因在胰腺癌中表达缺失，具有促进细胞凋亡的作用［5］。本研究探讨ARHI基因对胰腺癌细胞增殖的影响并对其机制进行研究，以期为临床研究奠定基础。

1材料与方法

1．1细胞和试剂人胰腺癌细胞株PANC－1(北京协和医院)，细胞培养试剂(Gibco，USA)，四甲基偶氮唑盐(MTT)细胞增殖检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)，蛋白提取试剂(北京全式金生物有限公司)，Western blotting实验试剂(普利莱基因技术有限公司)，细胞周期检测试剂〔RNA酶、碘化丙啶(PI)〕(Sigma，USA)，ARHI兔抗人多克隆抗体和ARHI小鼠抗人单克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司)，β－Actin兔抗人多克隆抗体(Santa Cruze，美国)，丝氨酸蛋白激酶(serine－threonine kinase，AKT)、磷酸化丝氨酸蛋白激酶(phospho－serine－threonine kinase，p－AKT)兔抗人多克隆抗体(Cell Sigalling Technology，USA)，p53兔抗人多克隆抗体(Santa Cruze，USA)，p21WAF1兔抗人多克隆抗体(Sigma，USA)，MDM2兔抗人多克隆抗体(Sigma，USA)，PI－3K/AKT抑制剂LY294002(Sigma，USA)，p IRES2－EGFP质粒、p IRES2－EGFP－ARHI质粒(北京协和医院消化内科实验室)。

1．2稳定转染胰腺癌细胞株的建立和培养2009年3—9月应用瞬时转染法分别对PANC－1细胞转染p IRES2－EGFP质粒(作为对照)和pIRES2－EGFP－ARHI质粒，在48 h时加入新霉素(PANC－1为900 μg/m l)进行筛选，每天倒置显微镜下和荧光显微镜下观测。每天换用新的培养基以及新霉素，维持筛选压力。第14天时，荧光显微镜下可见散在绿色荧光细胞，即成功建立了稳定表达ARHI基因和空载体的胰腺癌细胞株，以后每2～3 d换用新的培养基及新霉素。稳定转染的胰腺癌细胞株中ARHI基因和蛋白表达鉴定见文献［5］，细胞培养于DMEN培养基中(含10%胎牛血清)，在37℃、5%CO2培养箱中进行培养，每3 d换用新鲜培养基。

1．3细胞分组Control组:无转染质粒的PANC－1细胞;Vector组:稳定表达pIRES2－EGFP质粒的PANC－1细胞;ARHI组:稳定表达pIRES2－EGFP－ARHI质粒的PANC－1细胞。

1．4细胞增殖检测应用MTT法检测3组细胞增殖情况。应用移液器将Control组、Vector组、ARHI组细胞分别加入96孔板不同的3排〔每孔中加入细胞悬液100 μl(1×104个胰腺癌细胞)〕进行培养。在培养第0、1、2、3、4、5天测定3组细胞吸光度(optical density，OD值);在进行每个时间点测定之前，每孔每100μl培养基加入10μl MTT Stock，继续温育4 h;吸除培养基后，在每孔中加入100μl MTT溶解剂，在37℃培养箱内继续温育4 h;应用酶标仪在570 nm处测定OD值，实验重复5次，取平均值。

1．5细胞周期检测应用流式细胞仪检测3组细胞周期。应用培养基将胰腺癌细胞消化成单细胞悬液后，应用70%乙醇溶液固定细胞，4℃过夜;第2天离心(200×g，离心10 min)，去掉乙醇固定液，在细胞中加入RNA酶溶液，在37℃条件下温育20 min后，应用冰浴终止RNA酶的作用;再加入PI染液，置于4℃避光染色40 min;应用流式细胞仪测定细胞在各周期所占比例，实验重复5次，取平均值。

1．6 LY294002的配制及应用在洁净台中向LY294002试剂瓶中加入二甲基亚砜(DMSO)581．7μl，配成500 μmol/L存储液，4℃保存，使用时溶解，以1/100体积加入ARHI表达的细胞培养基中，应用LY294002抑制细胞12 h后，终止实验，提取蛋白。

1．7蛋白提取方法同笔者前期研究［5］。

1．8蛋白检测采用Western blotting法进行蛋白检测。制备十二烷基硫酸钠(SDS)－聚丙烯酰氨凝胶(PAGE)，样品变性及电泳，转膜，封闭、抗体孵育及曝光。检测ARHI、p－AKT、MDM2、p53、p21WAF1、AKT表达情况。然后应用LY294002(50μmol/L)处理ARHI组细胞检测ARHI、p－AKT、MDM2、p53、p21WAF1、AKT表达情况。

1．9统计学方法应用SPSS 11．5统计学软件对数据进行分析，计量资料以(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。以P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1 3组培养不同时间点细胞增殖情况比较3组培养第1、2、3、4、5天细胞增殖情况比较，差异均有统计学意义(P＜0．05)。Vector组培养第4、5天细胞增殖情况与Control组比较，差异有统计学意义(P＜0．05)。ARHI组培养第1、2、3、4、5天细胞增殖情况与Control组和Vector组比较，差异均有统计学意义(P＜0．05，见表1)。

2．2 3组细胞周期比较3组细胞周期比较，差异均有统计学意义(P＜0．05)。Vector组G0－G1期、S期细胞所占比例与Control组比较，差异有统计学意义(P＜0．05)。ARHI组G0－G1期、S期细胞所占比例与Control组和Vector组比较，差异有统计学意义(P＜0．05)。ARHI组G2－M期细胞所占比例与Control组比较，差异有统计学意义(P＜0．05，见表2)。

2．3蛋白检测与Control组和Vector组相比，ARHI组p－AKT、MDM2表达降低，p53、p21WAF1表达增多，而AKT表达没有变化(见图1A)。ARHI组加入LY294002与未加入LY294002相比，p－AKT、MDM2表达降低，p53、p21WAF1表达增加，而ARHI、AKT表达没有变化(见图1B)。

3讨论

在西方国家，胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，其病死率占恶性肿瘤的第4位［6］，在我国胰腺癌的发病率居恶性肿瘤的第5～7位［7］。有研究报道，胰腺癌患者1年存活率低于20%，5年存活率仅为3%［8］。胰腺癌的发病率与病死率十分接近，预后非常差［8］。因此，应加强胰腺癌基因和分子水平的研究，以提高胰腺癌的诊治水平。

在肿瘤细胞周期调控过程中，抑癌基因或其产物发挥了重要作用。ARHI基因是在正常胰腺上皮细胞表达而在胰腺癌中表达缺失的抑癌基因，该基因可以抑制丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、激活c－Jun信号转导通路［3，9］。ARHI基因在乳腺癌中可以上调p21WAF1表达和下调cyclin D1启动子的活性。故本研究对ARHI基因抑制胰腺癌细胞增殖的机制进行了研究。

表2 Control组、Vector组及ARHI组细胞周期比较(x±s，%，n=5)Table 2 Comparison of cell cycle among the three groups

图1蛋白表达电泳图Figure 1 Electrophoretogram of protein expression

表1 Control组、Vector组及ARHI组培养不同时间点细胞增殖情况比较(±s，n=5)Table 1 Comparison of cell proliferation at different time points among the three groups

表1 Control组、Vector组及ARHI组培养不同时间点细胞增殖情况比较(±s，n=5)Table 1 Comparison of cell proliferation at different time points among the three groups

注:与Control组比较，aP＜0．05;与Vector组比较，bP＜0．05

组别第0天第1天第2天第3天第4天第5天Control组0．040±0．010 0．070±0．006 0．210±0．039 0．350±0．070 0．580±0．090 1．201±0．163 Vector组0．043±0．004 0．058±0．006 0．190±0．014 0．317±0．023 0．490±0．050a0．710±0．080aARHI组0．048±0．001 0．046±0．003ab0．060±0．013ab0．093±0．011ab0．118±0．006ab0．186±0．023abF 值＞0．05＜0．01＜0．01＜0．01＜0．01＜0．01 1．52 13．29 33．27 49．74 44．06 58．21 P值

本研究观察了稳定表达ARHI基因的胰腺癌细胞增殖情况，发现ARHI组第1、2、3、4、5天细胞增殖低于Control组和Vector组，而Vector组第4、5天细胞增殖低于Control组，提示ARHI组细胞增殖减慢，抑制细胞增殖较明显。有研究表明，ARHI作为抑癌基因，可以明显抑制细胞的生长［3］，本研究结果与之一致。同时，为了更充分地研究ARHI基因的抑癌作用，本研究应用流式细胞仪检测了ARHI基因对胰腺癌细胞周期的影响，细胞周期分为4个时相:G1期、S期、G2期和M期，许多影响细胞增殖的调控均发生在G1期。本研究结果显示，与Control组和Vector组相比，ARHI组G0－G1期细胞所占比例较高，S期细胞所占比例较低，而Vector组和ARHI组G2－M期细胞所占比例无差异，说明ARHI基因可以导致细胞分裂减慢或停止分裂，细胞周期表现为G1期停滞和DNA合成期S期的减少。

PI－3K/AKT信号转导通路参与了许多信号转导通路的调节，并且对肿瘤中许多异常调节的过程有深远影响，在调节胰腺癌细胞生长和增殖方面起着重要作用［10－11］。因为ARHI基因属于Ras超家族，PI－3K/AKT信号转导通路属于Ras超家族经典信号转导通路之一［12］，所以笔者重点研究了ARHI基因是否可通过抑制PI－3K/AKT信号转导通路进而发挥抑癌作用。本研究结果显示，与Vector组比较，ARHI组p－AKT表达减少，而AKT表达没有明显变化。ARHI基因调控肿瘤细胞周期，抑制了PI－3K/AKT信号转导通路，从而阻滞G1期向S期进行。因此，ARHI基因抑制细胞增殖，导致细胞周期停止，与PI－3K/AKT信号转导通路有密切关系，为后续临床研究奠定了基础。

PI－3K/AKT信号转导通路下游有多个作用位点，其中MDM2是该通路下游的一个重要效应分子(PI－3K/AKT/MDM2)［13］，其可以与p53结合，负向调控p53，而p53是参与调节细胞周期、控制细胞增殖和凋亡的中枢性调节因子。DNA损伤检查点作用于细胞周期3个阶段，其中G1期/S期交界处的DNA损伤检查点由“p53途径”控制，而p53是DNA损伤检查点的关键因子［14］，当DNA损伤或衰老时，信号转导引起转录因子p53累积，从而诱导细胞周期依赖的蛋白激酶(CDK)抑制p21WAF1的转录增强，再与cyclin－CDK复合物结合，抑制CDK活性，进而抑制细胞增殖，导致细胞周期停滞［15］。本研究结果发现，ARHI基因转染胰腺癌细胞后，能够明显下调p－AKT和MDM2的表达，而p53表达明显增加，后者诱导p21WAF1表达上调，与Vector组相比有明显的改变。为了证实ARHI基因是否通过PI－3K/AKT/MDM2发挥作用，笔者应用LY294002干预ARHI表达的胰腺癌细胞，发现应用LY294002后，p－AKT、MDM2表达下调，同时上调了p53和p21WAF1的表达，提示ARHI基因抑制胰腺癌细胞增殖是通过PI－3K/AKT信号转导通路进行的，同时也说明与p53和p21WAF1的表达增加有关。

总之，ARHI基因作为抑癌基因，可以明显抑制胰腺癌细胞的生长，使细胞周期停滞G1期，这与PI－3K/AKT/MDM2/p53信号转导通路有直接关系，表明ARHI基因在胰腺癌发生中起着重要作用，为进一步临床研究提供借鉴。但本研究仅在细胞水平探讨了ARHI基因的抑癌作用，后续实验还需要进行ARHI基因在动物和临床方面的研究。

［1］Seicean A，Petrusel L，Seicean R．New targeted therapies in pancreatic cancer［J］．World J Gastroenterol，2015，21(20): 6127－6145．

［2］Rahib L，Smith BD，Aizenberg R，et al．Projecting cancer incidence and deaths to 2030:the unexpected burden of thyroid，liver，and pancreas cancers in the United States［J］．Cancer Res，2014，74 (11):2913－2921．

［3］Hu YQ，Si LJ，Ye ZS，et al．Inhibitory effect of ARHIon pancreatic Cancer cells and NF－κB activity［J］．Mol Med Rep，2013，7 (4):1180－1184．

［4］Hu Y，Yang H，Lu XQ，etal．ARHIsuppresses pancreatic cancer by regulating MAPK/ERK 1/2 pathway［J］．Pancreas，2015，44 (2):342－343．

［5］Lu XQ，Li GY，Wang DF，et al．Mechanism of apoptosis induced by ARHI gene in pancreatic cancer cells［J］．Clinical Focus，2011，26(24):2145－2148．

［6］Kim VM，Ahuja N．Early detection of pancreatic cancer［J］．Chin J Cancer Res，2015，27(4):321－331

［7］Chen WQ，Wang QS，Zhang SW，et al．An analysis of incidence and mortality of pancreas cancer in China，2003～2007［J］．China Cancer，2012，21(4):248－253．(in Chinese)陈万青，王庆生，张思维，等．2003～2007年中国胰腺癌发病与死亡分析［J］．中国肿瘤，2012，21(4):248－253．

［8］Jemal A，Murray T，Ward E，et al．Cancer statistics［J］．CA Cancer JClin，2005，55(1):10－30．

［9］Klingauf M，Beck M，Berge U，et al．The tumour suppressor DiRas3 interactswith C－RAF and downregulates MEK activity to restrict cell migration［J］．Biol Cell，2013，105(2):91－107．

［10］Faes S，Dormond O．PI3K and AKT:unfaithful partners in cancer［J］．Int JMol Sci，2015，16(9):21138－21152．

［11］Xia P，Xu XY．PI3K/Akt/mTOR signaling pathway in cancer stem cells:from basic research to clinical application［J］．Am JCancer Res，2015，5(5):1602－1609．

［12］Ciuffreda L，Incani UC，Steelman LS，et al．Signaling intermediates (MAPK and PI3K)as therapeutic targets in NSCLC［J］．Curr Pharm Des，2014，20(24):3944－3957．

［13］Li J，Kurokawa M．Regulation of MDM2 stability after DNA damage［J］．JCell Physiol，2015，230(10):2318－2327．

［14］Sun T，Cui J．Dynamics of P53 in response to DNA damage: Mathematical modeling and perspective［J］．Prog Biophys Mol Biol，2015，119(2):175－182．

［15］Warfel NA，El－Deiry WS．p21WAF1and tumourigenesis:20 years after［J］．Curr Opin Oncol，2013，25(1):52－58．

M echanism of ARHIGene in Inhibiting Pancreatic Cancer Cell Proliferation

LU Xin－qing，YANG Hong，LI Jing－nan，et al．Chinese Academy of Medical Sciences，Department of Gastroenterology，Peking Union Medical College Hospital，Beijing 100730，China

ObjectiveTo investigate impact of ARHI gene on the proliferation of pancreatic cancer cells and the mechanism of ARHIgene in inhibiting cell proliferation．M ethods From March to September in 2009，the study selected human pancreatic cancer cell lines from Peking Union Medical College Hospital，and divided them into three groups:Control group (PANC－1 cells without plasmid transfection)，Vector group(PANC－1 cells with stable expression of p IRES2－EGFP plasmid)，ARHIgroup(PANC－1 cells with stable expression of pIRES2－EGFP－ARHI plasmid)．Using methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)method，the proliferation of these pancreatic cancer cells on day 0，day 1，day 2，day 3，day 4 and day 5 were analyzed;flow cytometry was applied to detect cell cycle;using western blotting method，the expression levels of ARHI，p－AKT，MDM2，p53，p21WAF1and AKT of the three groups were detected;PI－3K/AKT inhibitor LY294002 was used to conduct intervention on ARHI group，and the expression levels of ARHI，p－AKT，MDM2，p53，p21WAF1and AKT were detected．Results The three groupswere significantly different in cell proliferation on day 1，day 2，day 3，day 4 and day 5(P＜0．05)．Vector group and Control group were significantly different in cell proliferation on day 4 and day 5(P＜0．05);ARHI group was significantly different from Control group and Vector group in the cell proliferation on day 1，day 2，day 3，day 4 and day 5(P＜0．05)．The three groupswere significantly different in cell cycle(P＜0．05)．Vector group and Control group were significantly different in the cell proportion in stage G0－G1and stage S(P＜0．05);ARHIgroup was significantly different fromControl group and Vector group in stage G0－G1and stage S(P＜0．05);ARHI group and Control group were significantly different in cell proportion in stage G2－M(P＜0．05)．Compared with Control group and Vector group，the expression levels of p－AKT and MDM2 decreased and the expression levels of p53 and p21WAF1increased，while the expression level of AKT had no change in ARHI group;after the ARHI group was added inhibitor LY294002，the expression levels of p－AKT and MDM2 decreased，and the expression levels of p53 and p21WAF1increased，while the expression levels of ARHI and AKT had no change．Conclusion ARHIgene improves the expression levels of p53 and p21WAF1by inhibiting PI－3K/AKT/MDM2 passage and plays an important part in the occurrence of pancreatic cancer．

Pancreatic neoplasms;Cell proliferation;PI－3K/AKT;ARHIgene;Cell cycle

R 735．9

A

10．3969/j．issn．1007－9572．2015．36．011

2015－10－20;

2015－11－11)

(本文编辑:李婷婷)

国家自然科学基金资助项目(30670963);河北省科技支撑计划项目(13277744D，14277735D)

100730北京市，中国医学科学院，北京协和医院消化内科

钱家鸣，100730北京市，中国医学科学院，北京协和医院消化内科;E－mail:qianjiaming1957@126．com